Dimension FastScan生物原子力顯微鏡 （AFM） 可實現(xiàn)生物動力學(xué)的高分辨率研究，實時樣品觀測的時間分辨率高達(dá)每秒 3 幀。

更重要的是，它同時使AFM比以往更容易使用。Dimension FastScan Bio AFM 以世界先進(jìn)的大樣本 AFM 平臺為基礎(chǔ)，增添了專門的生物樣品表征功能，用于對分子間相互作用、膜蛋白、DNA 蛋白相互結(jié)合、細(xì)胞間信號傳輸和許多其他動態(tài)生物學(xué)研究，進(jìn)行高分辨率、活樣觀察。 

Dimension FastScan的優(yōu)點

· 大樣品、快速掃描

· 簡化進(jìn)樣和控制，實現(xiàn)即時成像

· 實時平移、縮放和掃描

· 特征跟蹤和影片創(chuàng)建工具

· 帶可控液體交換的微體積液體池

· 允許研究人員觀察和研究生物分子的工作機制。

· 提供簡單而即時的納米級生物成像

· 為使用商業(yè)化或定制探針提供靈活性

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根據(jù)NCBI的ClinVar數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，包括罕見疾病，如鐮狀細(xì)胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異（SNV）有關(guān)，SNV可能導(dǎo)致原始DNA序列、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術(shù)——堿基編輯器（BEs）可以有效地修復(fù)堿基突變，而不會誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變，對于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經(jīng)報道的有誘導(dǎo)C·G到T·A轉(zhuǎn)化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、誘導(dǎo)A·T到G·C轉(zhuǎn)化的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和使C·G到G·C轉(zhuǎn)換的糖基化酶堿基編輯器（GBE），這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。

然而，在實施基于BE的基因療法之前，有必要大量構(gòu)建具有致病性SNV的細(xì)胞疾病模型，以用于開發(fā)和優(yōu)化BEs，并使其在基因治 療中的應(yīng)用成為可能。同時，根據(jù)ClinVar的數(shù)據(jù)，大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉(zhuǎn)化，然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細(xì)胞模型。這一方面是由于大規(guī)模樣品，手動操作不僅耗時，而且容易出錯，一致性較差且成本高昂；另外一方面，現(xiàn)有的基于目標(biāo)-位點集成庫的方法，如Be-Hive等在為AI學(xué)習(xí)和預(yù)測編輯性能的數(shù)據(jù)時，缺乏原位信息的綜合編輯位點數(shù)據(jù)，同時又缺少真實染色體環(huán)境（先前研究表明，核酸酶的性能與染色質(zhì)可及性之間存在很強的相關(guān)性，并且基因編輯在真核染色質(zhì)中比異染色質(zhì)中更有效）。

中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所和天津科技大學(xué)的團隊，開發(fā)了一個由以下四個模塊組成的用于哺乳動物細(xì)胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細(xì)胞基因編輯的標(biāo)準(zhǔn)化和可拓展性。

（1）內(nèi)源性靶g(shù)RNA計算機輔助設(shè)計；

（2）gRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；

（3）哺乳動物細(xì)胞堿基編輯；

（4）CBEs性能模型構(gòu)建的機器學(xué)習(xí)。

四個模塊組成的用于哺乳動物細(xì)胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細(xì)胞基因編輯的標(biāo)準(zhǔn)化和可拓展性。該平臺借助大規(guī)模的原位編輯數(shù)據(jù)和序列信息，結(jié)合局部染色質(zhì)可及性，具有原位數(shù)據(jù)的機器學(xué)習(xí)模型能夠更好地預(yù)測實際的堿基編輯效率，使獲得內(nèi)生目標(biāo)的大規(guī)模編輯數(shù)據(jù)集成為可能。

圖1 全自動高通量哺乳動物基因編輯平臺概覽

在這四個模塊中，第 一個模塊用于負(fù)責(zé)gRNA設(shè)計，以將人類致病性SNV引入野生型細(xì)胞，作者使用生物信息學(xué)分析選擇了1210個基因作為靶位點，使用包含每個靶位點上游3 bp至下游750 bp靶區(qū)的DNA序列，分批處理用于分析編輯結(jié)果的三對引物。對于自動化gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程模塊，gRNAs質(zhì)粒構(gòu)建過程中采用了貝克曼庫爾特Echo納升級聲波移液系統(tǒng)用于操縱DNA組裝反應(yīng)，相對于標(biāo)準(zhǔn)的Golden Gate DNA組裝方法的反應(yīng)體積為15μl，Echo的納升級和無吸頭操作能夠?qū)嶒灢襟E進(jìn)行一系列優(yōu)化，將反應(yīng)系統(tǒng)最小化到1微升的總體積，從而顯著降低了實驗成本。

隨后使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站將DH5α感受態(tài)細(xì)胞與Golden Gate產(chǎn)物進(jìn)行混合，通過ClonePix進(jìn)行轉(zhuǎn)化鋪板，并在通過DNA測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒之后，使用Biomek i7進(jìn)行質(zhì)粒提取。為了分析數(shù)據(jù)編輯結(jié)果，使用Python腳本讀取sanger測序文件，比較N20，并創(chuàng)建兩個參考csv文件。錯誤的組裝csv文件包括一個選擇列表，用于從48孔細(xì)菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落，以便ClonePix進(jìn)行另一輪驗證。正確組裝csv文件包含N20測序及其在96孔深孔板中的位置，用于使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站進(jìn)行質(zhì)粒提取。此模塊高通量自動化系統(tǒng)在4天之內(nèi)共構(gòu)建和分析了1210個gRNA質(zhì)粒，成功率達(dá)99%，實現(xiàn)了每天384個gRNA組裝的通量。而后續(xù)使用Biomek i7進(jìn)行的質(zhì)粒提取，通量則可達(dá)到576個質(zhì)粒/天。

圖2 全自動gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程概述示意圖

第三個模塊是哺乳動物細(xì)胞中的堿基編輯，如圖3。通過優(yōu)化實驗條件，作者開發(fā)了使用Biomek i7自動化移液工作站進(jìn)行包括細(xì)胞接種和轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)基更換以及進(jìn)行樣品收集在內(nèi)的編輯過程。隨后進(jìn)行靶區(qū)域的細(xì)胞裂解和PCR擴增。全自動高通量系統(tǒng)在6h內(nèi)將1210組gRNA和BE4max質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，并在2 h內(nèi)完成后續(xù)培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)5天后，收獲編輯的細(xì)胞于8小時內(nèi)完成進(jìn)行PCR分析，然后進(jìn)行sanger測序。使用Python腳本產(chǎn)生3個csv文件，一個用于準(zhǔn)備新一輪PCR的挑選列表，以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample；第二個csv文件包含用于分析false sample的第二個引物對的序列和位置信息，用于新一輪PCR；第三個csv文件包含正確的樣本和編輯效率結(jié)果，用于下一步的AI學(xué)習(xí)。

圖3 自動化基因編輯過程的工作流程概述

第四個模塊為作者開發(fā)的AI模型——染色質(zhì)可及性學(xué)習(xí)模型（CAELM），預(yù)測基礎(chǔ)編輯的結(jié)果。CAELM基于自動化平臺生成的高度均勻的原位基因組編輯數(shù)據(jù)，預(yù)測HEK4T細(xì)胞中的BE293max行為，并實現(xiàn)了0.64的皮爾遜相關(guān)值。皮爾遜r是評估數(shù)值數(shù)據(jù)模型準(zhǔn)確性的最普遍指標(biāo)之一，CAELM模型中考慮了目標(biāo)序列的真實染色體環(huán)境，這提供了更好、更現(xiàn)實的預(yù)測；同時，CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分，并揭示了DNA可及性相對于目標(biāo)序列上下文的貢獻(xiàn)在預(yù)測中接近1:6。

通過與32個不同基因組位點的手動操作進(jìn)行比較，其中16個目標(biāo)位點在兩個操作過程中的編輯效率幾乎相等，而自動化高通量系統(tǒng)在其他14個位點的統(tǒng)計分析中表現(xiàn)出更高的編輯效率。這些結(jié)果表明，自動化高通量系統(tǒng)能夠以與手動操作相當(dāng)?shù)男蕡?zhí)行基礎(chǔ)編輯；隨機選擇BE4max編輯靶標(biāo)的1210個與疾病相關(guān)的SNV的編輯效率均達(dá)到了較高水平，說明可以同時有效地操縱數(shù)千個內(nèi)源性靶位點的人類細(xì)胞的全自動高通量原位基因編輯平臺的成功建立。