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  飾演故事角色 2016-02-24 00:00:00

  組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細胞中抽提 RNA 不容易降解?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速YZ Rnase 的成分。在培養(yǎng)細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即YZ住細胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在YZ RNA 活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是Z有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何YZ Rnase 活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 能獲得解決。影響后續(xù)實驗的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。總之，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì)。 實驗前方法/試劑的選擇 0：抽提 RNA 的目的 RNA 用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)YZ物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)YZ物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)YZ物殘留要求嚴格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得Z高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。 1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素 樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個辦法可以徹底YZ內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，，，腦，脂肪，肌肉組織等Z好都先用液氮冷凍起來，再往下做。 2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素 樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。細胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，，，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。Z可靠而且得率Z高的破碎方法是使用液氮的碾磨，Z可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點：在整個碾磨過程中，樣品不得融化，因為冷凍后內(nèi)源酶更容易起作用。 3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素 常用的裂解液幾乎都能YZ Rnase 活性，因此，選擇裂解液的ZD是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。 4：純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素 對于干凈的樣品，如細胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價格較貴；使用經(jīng)濟而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時間長。

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