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  尚胤軒 2017-01-09 00:00:00

  用流式細胞儀測成年大鼠心肌細胞內鈣 原代培養(yǎng)心肌細胞作為一種主要的研究模型，被廣泛應用于心血管研究之中.我們實驗室經(jīng)過長期嘗試，摸索出了一些行之有效的方法，并積累了一些經(jīng)驗，現(xiàn)總結如下： 1新生大鼠鼠齡的選擇新生大鼠心肌細胞在出生后3 d內具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌細胞則為終末分化細胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生時間越短，其心肌細胞分離后成活率越高，越容易貼壁生長.大量觀測表明，選擇1~3 d齡大鼠分離其心肌細胞進行原代培養(yǎng)較為理想.其中尤以半日齡大鼠心肌細胞培養(yǎng)效果Z佳. 2消化酶的選擇及使用 新生大鼠心肌細胞的分離可采用組織塊法和消化法，前者因不易獲得密度均一的細胞且難控制成纖維細胞的生長而較少采用.消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶I或Ⅱ以及透明質酸酶.透明質酸酶多與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應用.胰蛋白酶作用較強，容易造成心肌細胞損壞.膠原酶作用較緩和，能消化細胞間質中的膠原纖維以釋放細胞，對細胞損傷小，且在新生大鼠心肌組織，以膠原I為主，故我們選用膠原酶I.文獻報道膠原酶的工作濃度一般在0.6~1 g・L1，我們使用的為0.8 g・L1.膠原酶Z好現(xiàn)用現(xiàn)配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌細胞對酶消化極為敏感.消化過度可使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動能力;消化不足，細胞聚集成團，無法分清細胞邊界，難以形態(tài)學觀測.消化過程中使用磁力攪拌器時應注意1)轉速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的時間須結合消化酶濃度確定.(3)將粘附在攪拌子上的心肌組織吹散，使酶液充分接觸組織.(4)適宜溫度為35~37℃.(5)當組織由紅轉白呈半透明狀態(tài)時，應停止消化. 4接種的細胞密度 心肌細胞接種密度不僅影響細胞間的相互接觸，進而影響細胞對肥大刺激的反應，而且影響長期培養(yǎng)細胞的成活率.接種細胞的數(shù)量應經(jīng)精確計算.一般而言，應根據(jù)實驗的觀測目的決定單位面積上的細胞數(shù)量.例如，如作形態(tài)學觀測，六孔板中每孔的接種細胞數(shù)量應控制在1×105~2×105個;若需收獲心肌細胞作mRNA或蛋白表達水平的觀測，則每孔的接種密度可增加到5×105~6×105個.

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