大家好！首先跟大家做一個(gè)自我介紹：

我是擴(kuò)增曲線，來(lái)自熒光定量PCR，是用于描述qPCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線，我有兩種形態(tài)，一種是線性圖譜：橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是熒光強(qiáng)度值；另一種是對(duì)數(shù)圖譜：橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是熒光強(qiáng)度值的對(duì)數(shù)。大家根據(jù)我來(lái)確定Cq值，最終確定初始模板的含量。新冠疫情以來(lái)，我可是發(fā)揮了重要的作用，診斷技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，驕傲的很呢。

在引物、模板、緩沖液、酶等都充足的理想狀態(tài)下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物理論上是呈2的倍數(shù)增長(zhǎng)的，所以我應(yīng)該是長(zhǎng)這個(gè)樣子的：

▲ 圖1. 理論的擴(kuò)增曲線線性圖譜

但是呢，理想很美好，現(xiàn)實(shí)卻很骨感，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭等諸多因素影響了PCR擴(kuò)增效率，實(shí)際的我是長(zhǎng)這樣的：

▲ 圖2. 實(shí)際的擴(kuò)增曲線線性圖譜

不過(guò)S型的曲線，曼妙的身材，我還是很滿意的。

大家也根據(jù)我將PCR進(jìn)程分為4個(gè)時(shí)期，分別為基線期，指數(shù)增長(zhǎng)期，線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。我的特征還是很明顯的：基線期平整；指數(shù)期起峰，陡度較大；線性期慢慢趨于平整；平臺(tái)期基本平整。

▲ 圖3. 擴(kuò)增曲線的各個(gè)時(shí)期

如果大家在每次實(shí)驗(yàn)中都能遇到如此美麗的我，那就是“你好我好大家好”的歡快場(chǎng)景了。但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大家可能會(huì)看到各種奇形怪狀的我，分析不出原因，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)止步不前，因此茶飯不思，郁郁寡歡。

其實(shí)主要還是大家對(duì)我不太了解。我，作為大家的科研小助手，單純善良，心思簡(jiǎn)單，沒(méi)有那么多套路的。之所以出現(xiàn)奇奇怪怪的我，都是有原因的。接下來(lái)可都是滿滿的干貨吆！筆記要做起來(lái)了吆！

一． 沒(méi)有Cq值出現(xiàn)

1. 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)定在35個(gè)循環(huán)以上，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)數(shù)。

2. 引物/探針設(shè)計(jì)不當(dāng)或發(fā)生降解：優(yōu)化引物/探針的設(shè)計(jì)；或通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。

3. 模板濃度低或降解導(dǎo)致：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；同時(shí)樣品制備時(shí)盡量避免引入雜質(zhì)和反復(fù)凍融。

二．Cq值偏大

1. 模板濃度低：建議提高樣本的上樣量。

2. 擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不適宜或引物探針設(shè)計(jì)不當(dāng)，建議通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴(kuò)增效率，同時(shí)對(duì)反應(yīng)條件和引物探針設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。

3. PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。如果擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)，建議用三步法程序擴(kuò)增或優(yōu)化引物。

4. 反應(yīng)體系中可能有PCR反應(yīng)抑制物：建議將模板梯度稀釋后加入反應(yīng)體系，或者重新制備純度更高的模板。

三．?dāng)U增曲線末尾起跳，但沒(méi)有完整擴(kuò)增

1. 可能存在污染：建議對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢。

2. 如果是陰性對(duì)照，可能是引物二聚體或污染導(dǎo)致；如果是正常樣本，說(shuō)明濃度過(guò)低或者加樣量不足。

四．復(fù)孔重復(fù)性差

1. 加樣誤差導(dǎo)致：定期校準(zhǔn)移液器；同時(shí)可先配制除模板以外的其他試劑的預(yù)混液，然后進(jìn)行分裝再加入模板，其次加大模板上樣體積，以上均可降低移液誤差的影響。

2. 模板濃度越低，重復(fù)性越差。建議提高模板量，使Ct值在15-30之間。

現(xiàn)在大家對(duì)我的了解是不是又多了一些呢？是不是對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)又充滿了信心呢？那就趕緊行動(dòng)起來(lái)吧！Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，沒(méi)有他就沒(méi)有我那么多標(biāo)致的圖片，快快申請(qǐng)?jiān)囉茫惺芩镊攘ρ剑?/p>

▲ 圖4. Azure Cielo? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

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拉伸試驗(yàn)機(jī)曲線不經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的原因?