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  潛新兒 2017-09-30 05:28:46

  　　1. 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，任何類型或等級的瓊脂糖都可以使用.我們強烈的建議您使用新鮮的TAE Buffer作為電泳緩沖液.不要重復(fù)使用電泳緩沖液，因為會因其PH的升高而減少產(chǎn)量.新鮮的TBE也可以用，但只能得到較低的產(chǎn)量. 　　2. 當(dāng)所需DNA片段完全分離時，轉(zhuǎn)移凝膠至紫外燈上，盡可能快地把所需的DNA片段切下來. 　　注:切膠時盡量把多余的凝膠切去，DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒. 　　3. 將帶有目的片段的凝膠塊轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管(離心管已經(jīng)稱重了)中，稱重得出凝膠塊的重量.近似地確定其體積.假設(shè)其密度為1g/ml(幾乎所有DNA凝膠的密度都可以近似為1g/ml)，于是凝膠塊的體積便可通過如下方法得到:凝膠薄片的重量為0.2g， 則其體積為 　　0.2 ml.加入等體積的Binding Buffer(XP2)，于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化，每2-3 min振蕩或渦旋混合物. 　　重要提醒:在凝膠完全溶解之后，注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值.如果其pH值大于8的話，DNA的產(chǎn)量將大大減少.觀察混和物的顏色，如果是橙色或紅色，則要加入5 ul 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值.經(jīng)過這一調(diào)節(jié)，該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色. 　　4. 取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(nèi)(已備好). 　　5. 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉(zhuǎn)移至柱子中.室溫下10，000 x g離心1分鐘.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi). 　　6. 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉(zhuǎn)移700ul至柱子中，余下的可繼續(xù)重復(fù)第5步至所有的溶液都經(jīng)過柱子.每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25gDNA的吸附能力.如果預(yù)期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱子中. 　　7. 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi).移300ul Binding Buffer(XP2)至柱子中，室溫下， 10，000 x g下離心1min. 　　8. 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi).移700ul SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中.室溫下10，000xg離心1min. 　　注意:濃縮的SPW Wash Buffer 在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋.如果DNA 洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下. 　　9. 重復(fù)用700ul SPW Wash buffer洗滌柱子.室溫下10，000xg離心1min. 　　10. 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi).室溫下，13，000 x g離心2 min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體. 　　11. 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30ul(具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度)的Elution Buffer(或TE緩沖液)到柱基質(zhì)上，室溫放置1min， 13，000xg離心1min以洗脫DNA. 　　diyi次洗脫可以洗出70-80%的結(jié)合DNA. 如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會較低.

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