對(duì)于病毒、致病菌的檢測(cè)，我們當(dāng)然希望越早檢出越好，這樣便于提前預(yù)防或盡早采取措施，然而，早期病菌數(shù)量少，要求檢測(cè)技術(shù)及設(shè)備具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性。越來(lái)越多的研究者注意到電化學(xué)技術(shù)高靈敏度的特性，直流電化學(xué)、交流阻抗測(cè)試技術(shù)等越來(lái)越多的應(yīng)用于病毒、細(xì)菌等生物檢測(cè)領(lǐng)域。

       手足口病病毒（FMDV）具有高度傳染性，Heba A設(shè)計(jì)的病毒印跡聚合物生物傳感器可以快速，準(zhǔn)確地檢測(cè)FMDV。作者使用Gamry G750電化學(xué)工作站，通過(guò)在金絲網(wǎng)印刷電極上進(jìn)行電化學(xué)聚合，構(gòu)建可以進(jìn)行生物識(shí)別的部分；然后使用循環(huán)伏安CV、原子力顯微鏡AFM等技術(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，Z終檢測(cè)限達(dá)到了2ng/mL，定量限達(dá)到6ng/mL。對(duì)于實(shí)際的唾液樣品，其檢測(cè)限比傳統(tǒng)的ELISA和PCR方法低50倍，并且樣品無(wú)需前處理，還可以實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)^[1]。

       直流電化學(xué)技術(shù)還被用于細(xì)菌活性的檢測(cè)，Rabeay用修飾過(guò)的碳電極測(cè)到鏈霉菌代謝活動(dòng)產(chǎn)生的氧化電流，發(fā)現(xiàn)電流的大小與細(xì)菌的活性相關(guān)，使用碳納米管作為電極材料獲得了很強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)。與以往的微生物檢測(cè)方法相比，這種方法可以有效地區(qū)分活的細(xì)菌和死的細(xì)菌；可以監(jiān)測(cè)不同條件下的細(xì)胞活性，用于質(zhì)量控制，或者YL、環(huán)境樣品中的特定病菌檢測(cè)，為下一步微生物傳感器設(shè)備的研究以及擴(kuò)大致病菌檢測(cè)范圍奠定了基礎(chǔ)^[2]。

       越來(lái)越多的證據(jù)證明miRNA在人的生理過(guò)程中起到很大的作用，然而，miRNA大約僅占總RNA質(zhì)量的0.01%（aM-nM），加上家族成員之間的相似性等，要求高度靈敏的檢測(cè)方法和工具，對(duì)miRNA的定量測(cè)定構(gòu)成了挑戰(zhàn)。目前主流的檢測(cè)技術(shù)在靈敏度方面或檢測(cè)所需的時(shí)間方面，并不十分令人滿(mǎn)意。Tanyu Wang報(bào)告了一種非?？焖伲恍枰徊讲僮鞯臒o(wú)標(biāo)記電化學(xué)傳感技術(shù)，作者在金微電極的表面自組裝修飾電極，形成硫醇-亞甲基藍(lán)-DNA的探針結(jié)構(gòu)，存在的miRNA被溶液中的TCEP還原，還原過(guò)程使用Gamry Reference 600電化學(xué)工作站循環(huán)伏安法CV，以及方波伏安法SWV檢測(cè)，測(cè)到大約幾個(gè)nA的響應(yīng)電流，Z終的miRNA檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.1fM，只需10分鐘就可完成^[3]。此方法非常適合用于快速檢測(cè)。

       美國(guó)Gamry電化學(xué)儀器公司提供業(yè)界ling先的超低噪聲、超微電流電化學(xué)工作站，尤其Reference 600+型號(hào)，是Gamry經(jīng)典型號(hào) Reference 600的延續(xù)和升級(jí)產(chǎn)品， yi流的內(nèi)部電路設(shè)計(jì)、智能濾波與屏蔽技術(shù)等使之性能zhuo越，儀器噪聲低于2μV，電流分辨率20aA，Z低電流檔位達(dá)到600fA，尤其擅長(zhǎng)測(cè)量微小的電流信號(hào)，已經(jīng)廣泛用于化學(xué)生物傳感器、生物電化學(xué)、腐蝕測(cè)量、涂層評(píng)估等小電流測(cè)試領(lǐng)域。

Gamry Reference 600+電化學(xué)工作站

—— 業(yè)界ling先的超低噪聲、超微電流電化學(xué)工作站

—— 微量檢測(cè)，傳感器研究，Gamry助您一臂之力！

超低儀器噪聲≤2μV

超低電流分辨率20aA

超低電流檔位600fA

準(zhǔn)確測(cè)量高達(dá)1TΩ的樣品交流阻抗

參考文獻(xiàn)：

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2. Rabeay Y.A. Hassan, Hassan N.A. Hassan, Mohamed S. Abdel-Aziz, Elmorsy Khaled.Nanomaterials-based microbial sensor for direct electrochemical

detection of Streptomyces Spp.Sensors and Actuators B 203 (2014) 848–853.

3. Tanyu Wang, Gangli Wang, Didier Merlin, and Emilie Viennois.Chapter17:MiRNA Quantitation with Microelectrode Sensors Enabled by Enzymeless Electrochemical Signal Amplification.

MicroRNA Detection and Target Identification(Humana Press).249-263.

斑馬魚(yú)身體延長(zhǎng)而略呈紡錘形，頭小而稍尖，吻較短，全身布滿(mǎn)多條深藍(lán)色縱紋似斑馬，與銀白色或金黃色縱紋相間排列紋路比較有條理。在水族箱內(nèi)成群游動(dòng)時(shí)猶如奔馳于非洲草原的斑馬群，故此得斑馬魚(yú)之美稱(chēng)。斑馬魚(yú)和人類(lèi)基因有著87%的高度相似性，作為模式生物的優(yōu)勢(shì)很突出，這意味著其實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多數(shù)情況下適用于人體，常可用于水質(zhì)環(huán)境的監(jiān)測(cè)。

近期有位客戶(hù)需要一臺(tái)體視熒光顯微鏡用于斑馬魚(yú)研究，明美銷(xiāo)售經(jīng)理推薦體視熒光顯微鏡MZX81搭配顯微鏡相機(jī)MC50-S.

體視熒光顯微鏡MMZX81搭配顯微鏡MC50-S拍攝的斑馬魚(yú)

體視熒光顯微鏡MZX81采用優(yōu)異的無(wú)限遠(yuǎn)平行光路系統(tǒng)，LED熒光雙光路照明設(shè)計(jì)，性能優(yōu)越，是應(yīng)用于動(dòng)物活體成像；果蠅屬的分類(lèi)、熒光幼蟲(chóng)及麻醉成蟲(chóng)的篩選；線(xiàn)蟲(chóng)有動(dòng)能個(gè)體的鑒定篩選；以及斑馬魚(yú)、小鼠和雞胚胎的鑒定及胚胎觀察等研究的理想工具。

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單程細(xì)胞具有復(fù)雜生物學(xué)性質(zhì)，它們通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)ECM形成緊密的細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞連接，諸如上皮細(xì)胞通過(guò)這種特殊的鏈接方式構(gòu)成了屏障層保護(hù)人體免受外界損傷。因此細(xì)胞之間以及細(xì)胞基底的粘附力測(cè)定對(duì)于研究細(xì)胞粘附蛋白的機(jī)制有著重要意義。使用力學(xué)工具測(cè)量細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附力始終不是一件容易的事情。首先，由于細(xì)胞與基質(zhì)的作用力僅為nN級(jí)別，因此需要力學(xué)精度較高的設(shè)備才能夠測(cè)量，而且在這其中較為適合的工具為原子力顯微鏡（AFM）。原子力顯微鏡能夠提供納米級(jí)別的操作精度并可測(cè)量從pN~nN范圍的力譜。但是受制于AFM探針本身的限制，需要借助修飾手段才能夠讓細(xì)胞與探針固定到一起，這個(gè)過(guò)程十分繁瑣，并且由于需要大量手工操作很難實(shí)現(xiàn)高通量的測(cè)量。而不同的細(xì)胞由于細(xì)胞異質(zhì)性使得要想確定粘附力需要較多樣本才能獲得相對(duì)準(zhǔn)確的值，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)量直接限制了原子力探針在細(xì)胞粘附力上的應(yīng)用。

而多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀，它使用特殊的中空探針能夠輕松地通過(guò)負(fù)壓抓取細(xì)胞，取得和AFM近似精度的數(shù)據(jù)，無(wú)需在探針上進(jìn)行任何修飾，不會(huì)改變細(xì)胞表面的任何通路，從而能夠得到接近細(xì)胞原生的數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后能夠通過(guò)正壓快速丟棄用過(guò)的細(xì)胞，具備很高的自動(dòng)化，能夠快速測(cè)量細(xì)胞粘附力。

使用FluidFM對(duì)細(xì)胞操作的基本流程

FluidFM在粘附力測(cè)量上具備顯著優(yōu)勢(shì)。如圖所示，F(xiàn)luidFM能夠通過(guò)負(fù)壓將細(xì)胞吸附到原子力探針的末端，通過(guò)高精度位移臺(tái)的控制將細(xì)胞從基底上分離，并且同時(shí)記錄FD曲線(xiàn)。通過(guò)FD曲線(xiàn)能夠獲得最大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通過(guò)高度自動(dòng)化的控制系統(tǒng)能夠在短時(shí)間內(nèi)測(cè)量大量細(xì)胞粘附力，評(píng)估細(xì)胞群體分布以及細(xì)胞間差異，并且可有效避免傳統(tǒng)粘附力測(cè)量因準(zhǔn)備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而錯(cuò)過(guò)最佳測(cè)量時(shí)間導(dǎo)致的細(xì)胞粘附力改變，得到更為精準(zhǔn)的結(jié)果。近期，Agoston等人使用多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM實(shí)現(xiàn)了高通量細(xì)胞粘附力測(cè)量，對(duì)同種細(xì)胞不同區(qū)以及不同細(xì)胞之間的粘附力進(jìn)行測(cè)量和比較。

作者首先對(duì)Vero和Hela細(xì)胞在不同狀態(tài)下的粘附力進(jìn)行了測(cè)量和比較，總共測(cè)量了214個(gè)細(xì)胞。通過(guò)比較明膠涂層上處于單個(gè)細(xì)胞、孤島狀細(xì)胞、致密連接細(xì)胞以及單層細(xì)胞上游離細(xì)胞之間的粘附力，能夠明顯觀測(cè)到Vero細(xì)胞處于致密連接的細(xì)胞粘附力最大，大概在750 nN左右，隨著細(xì)胞單細(xì)胞層的稀疏，細(xì)胞粘附力有所下降，而處于細(xì)胞層頂部的細(xì)胞粘附力最低僅為50 nN左右。這一點(diǎn)充分說(shuō)明上皮細(xì)胞能夠在細(xì)胞之間形成緊密的連接，而處于細(xì)胞層外的細(xì)胞則幾乎沒(méi)有粘附力。而對(duì)于HeLa這樣的腫瘤細(xì)胞測(cè)量的結(jié)果卻顯示出了截然不同的結(jié)果，處于不同狀態(tài)的細(xì)胞有著近似的粘附力，基本都在200 nN左右，這與處于單個(gè)游離上皮細(xì)胞的粘附力十分接近，表明HeLa細(xì)胞在不同環(huán)境下仍然具有較高遷徙能力。

使用FluidFM對(duì)不同區(qū)域細(xì)胞的FD曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果和對(duì)比

       通過(guò)對(duì)這兩種細(xì)胞的最大粘附力、最大粘附能量、最大拉伸距離和細(xì)胞接觸面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可以發(fā)現(xiàn)，HeLa腫瘤細(xì)胞在粘附力和粘附能量上均有所降低，但是當(dāng)HeLa細(xì)胞形成了單層后，兩者區(qū)別不大。

對(duì)比Hela和Vero在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的最大粘附力、最大粘附能量、粘附拉伸距離和粘附面積。

再進(jìn)一步對(duì)Vero與HeLa細(xì)胞最大粘附力與距離和接觸面積進(jìn)行對(duì)比，依然可以得到與單獨(dú)比較粘附力相同的結(jié)果，并且最大能量與細(xì)胞接觸面積的比值中也存在著類(lèi)似的結(jié)果。由此可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)降低自身粘附力從而獲得了更好的遷移能力。

對(duì)不同狀態(tài)Vero和A549之間的粘附力/粘附距離、粘附力/粘附面積、粘附能量/粘附面積

總結(jié)

       細(xì)胞粘附力測(cè)定在細(xì)胞生命科學(xué)研究中起著至關(guān)重要的作用，然而傳統(tǒng)手段中有著各種各樣的局限性，主要原因是缺乏一種有效抓取細(xì)胞并進(jìn)行力學(xué)測(cè)定的手段?，F(xiàn)如今FluidFM技術(shù)在細(xì)胞粘附力測(cè)定中的應(yīng)用，使得研究者們有了一種能夠有效、低損的方式抓取細(xì)胞，配合原子力顯微鏡精確測(cè)量的特性，真正意義上做到精準(zhǔn)、無(wú)損、快速的測(cè)量單細(xì)胞粘附力，幫助研究者尋找細(xì)胞粘附力與細(xì)胞生命發(fā)展、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

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