1.3.色譜圖中所有峰拖尾或峰變形通常是由物理作用導(dǎo)致的，而非化學(xué)作用。

如果色譜圖中的峰形均表現(xiàn)相同類型的變形（圖3），則問題Z早應(yīng)出現(xiàn)在分析物通過色譜柱遷移之前（主要問題發(fā)生在分析物在色譜柱中遷移之前）。

這種峰形變形Z常見的致因是：玻璃料或柱頭的空隙部分堵塞（此類峰變形Z常見的原因是篩板部分堵塞或色譜柱頭塌陷）。

除非在推薦的pH范圍之外使用色譜柱，否則現(xiàn)在的柱子基本不會(huì)受到空隙的影響（輕易不會(huì)發(fā)生塌陷）。

但是，玻璃料（篩板）堵塞仍然是一個(gè)普遍存在的問題。對(duì)于5m顆粒柱（的色譜柱），入口端的玻璃料（篩板）通常具有2.0m的孔隙度；對(duì)于（顆粒）3m的色譜柱，具有0.5m的孔隙度。
如果顆粒物來自于樣品，或顆粒物是因泵密封磨損或流動(dòng)相到達(dá)色譜柱而產(chǎn)生的（磨損的泵密封圈或者流動(dòng)相顆粒物進(jìn)入色譜），它們通常會(huì)集中在玻璃料上（都聚集在篩板上）。

這些顆粒會(huì)影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動(dòng)路徑到達(dá)色譜柱，因此會(huì)晚于另一部分樣品。
由于此時(shí)（此位置）未發(fā)生分離，因此所有分析物會(huì)以相同的方式變形（被擾亂），進(jìn)而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。

為了防止（避免）這一問題，如果流動(dòng)相可能含有顆粒（如緩沖沉淀物或灰塵），應(yīng)對(duì)其進(jìn)行過濾；并在泵密封嚴(yán)重磨損（導(dǎo)致顆粒物的產(chǎn)生）之前更換新的泵密封（密封圈）。

如果樣品含有顆粒碎片（屑），應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行過濾（例如0.5m孔隙度過濾器（微孔濾膜））或?qū)ζ溥M(jìn)行短暫離心（例如5分鐘，>1500×g），以去除顆粒。

我們強(qiáng)烈建議在自動(dòng)進(jìn)樣器下游（之后）安裝0.5m孔隙度的串聯(lián)（在線）過濾器，以過濾任何意外進(jìn)入HPLC系統(tǒng)的顆粒物。如果串聯(lián)（在線）過濾器玻璃料（濾片）發(fā)生堵塞，系統(tǒng)背壓會(huì)升高；而更換玻璃料（濾片）十分簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)。采用串聯(lián)（在線）過濾器可顯著延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

圖3. 由于玻璃料或色譜柱空隙被部分堵塞（色譜柱篩板部分堵塞或色譜柱塌陷），色譜圖中所有峰形均出現(xiàn)了變形。

按分離機(jī)制的不同，GX液相色譜法可以分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。

這些方法在使用的過程中往往會(huì)遇到諸如鬼峰、基線漂移、拖尾、分叉峰、保留時(shí)間漂移、柱壓過高等系列問題，該如何解決這些問題呢？

01

用HPLC進(jìn)行分析時(shí)，保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?

• 關(guān)于漂移問題

1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定

2、流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

3、柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡

• 關(guān)于快速變化問題

1、流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定

2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出

3、流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合

02

液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?

1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子

2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子

3、可能柱超載，減少進(jìn)樣量

03

HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量

2、樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子

3、樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器

4、檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可

5、檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大，解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)

6、檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗

7、檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣

8、記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可

9、流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可

10、檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線

04

做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決?

1、泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理

2、比例閥失效，更換比例閥即可

3、泵密封墊損壞，更換密封墊即可

4、溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法

5、系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可

6、梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的

05

我Z近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么?

這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。

盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ods填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。

因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ods柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如三乙基胺(tea)，將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。

如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時(shí)間的重現(xiàn)。

06

我購(gòu)買的HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過高，請(qǐng)問為什么?

柱壓過高是HPLC柱用戶Z常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，可按下面步驟檢查問題的起因：

1、拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查

2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查

3、將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子。此時(shí)，不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查。只適用于使用過的柱子

4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系

一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

07

色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理?

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下(不包括梯度)，峰型應(yīng)對(duì)稱而尖銳。

但是，在對(duì)樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理的情況下，會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問題，而難以對(duì)色譜峰作出合理的解釋，對(duì)于新手來說更是如此。

色譜雙峰指的是一種物質(zhì)，在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，表明含二種物質(zhì)。這種情況分為四種原因：

• 色譜柱

如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都出現(xiàn)雙峰(出峰越快，雙峰的可能性會(huì)減少)，尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出了問題——柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。

如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵。將色譜柱反過來接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。

當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這時(shí)可以將進(jìn)樣頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。

• 溶劑極性及進(jìn)樣量

許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。

目前，HPLC分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。Z佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。

當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如，純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如，定量管為20μL，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比diyi峰小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時(shí)間會(huì)提前(相對(duì)進(jìn)樣量少而言)，將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！?/p>

這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。

上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。

• 樣品的特性

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。

在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如，紅霉素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測(cè)器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯。

• 參數(shù)

記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的。

例如，c-r3a數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2MS，HPLC為5MS，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎€(gè)峰或更多。

08

色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎?

不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。

如此情況是否會(huì)損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了?色譜柱還能使用嗎?

事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。

相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。

同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。

可以嘗SY一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤(rùn)填料表面;已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤(rùn)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。

09

使用peek管路和接頭需要注意什么問題?

如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用peek材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。peek管路容易連接;peek接頭不僅無需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。

使用此類材料的管路需要注意的是：peek對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解peek材料的明顯跡象，但，peek遇到上述溶劑會(huì)變脆。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但peek管只能耐受近4000psi(但多數(shù)hplc應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi)。

使用peek接頭時(shí)則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的peek接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。

10

液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響

• 等度保留

大多數(shù)色譜工作者知道等度洗脫時(shí)溫度會(huì)影響保留時(shí)間。擁有溫控系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室一般都有全天候溫控設(shè)置，但這種設(shè)置可能引起室溫顯著變化，這對(duì)整夜運(yùn)行的色譜系統(tǒng)就會(huì)有一些影響。

例如，我們實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度就設(shè)為4～7℃。在不同的季節(jié)，實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會(huì)使色譜峰離開“保留時(shí)間窗”，造成連續(xù)進(jìn)樣中產(chǎn)生一系列的無效數(shù)據(jù)。

還有一個(gè)可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實(shí)驗(yàn)室的位置。當(dāng)色譜柱正對(duì)著空調(diào)的送風(fēng)口時(shí)，雖然整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的溫度非常穩(wěn)定，但色譜系統(tǒng)的溫度就會(huì)不斷的變化。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。

• 梯度保留

溫度變化對(duì)梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢(shì)是一樣的。即便如此，若梯度洗脫時(shí)不控制溫度的話，保留值一般都會(huì)有較大的變化。

我們發(fā)現(xiàn)柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個(gè)重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時(shí)間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，Z后，溫度的不平衡會(huì)導(dǎo)致峰扭曲變形。這些提醒我們，如果想得到穩(wěn)定可靠的分離結(jié)果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。

11

為何會(huì)基線漂移

1、柱溫波動(dòng)。(即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器)

2、流動(dòng)相不均勻。(流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移)

3、流通池被污染或有氣體

4、檢測(cè)器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線)

5、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化

6、柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)

7、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

8、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高k’值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線

9、使用循環(huán)溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測(cè)器

10、檢測(cè)器沒有設(shè)定在Z大吸收波長(zhǎng)處

• 解決方法

1、控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器

2、使用HPLC級(jí)的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣

3、用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1n的硝酸。(不要用鹽酸)

4、取出阻塞物或更換管子。參考檢測(cè)器手冊(cè)更換流通池窗

5、更改配比或流速。為避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速

6、用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10～20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對(duì)試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱

7、檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑

8、改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子

9、重新設(shè)定基線。使用新的流動(dòng)相

10、將波長(zhǎng)調(diào)整至Z大吸收波長(zhǎng)處。重選檢測(cè)波長(zhǎng)

12

規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

1、在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣(尖銳峰)

2、漏液

3、流動(dòng)相混合不完全

4、溫度影響(柱溫過高，檢測(cè)器未加熱)

5、在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲)

6、泵振動(dòng)

• 解決方法

1、流動(dòng)相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。

2、檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

3、用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑

4、減少差異或加上熱交換器

5、斷開lc、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。

6、在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器

13

不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

1、漏液

2、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成

3、流動(dòng)相各溶劑不相溶

4、檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問題

5、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

6、檢測(cè)器內(nèi)有氣泡

7、流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音。

8、檢測(cè)器燈能量不足

9、色譜柱填料流失或阻塞

10、流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常

• 解決方法

1、檢查接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液

2、檢查流動(dòng)相的組成

3、選擇互溶的流動(dòng)相

4、斷開檢測(cè)器和記錄儀的電源，檢查并更正

5、用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)

6、清洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

7、用1n的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

8、更換燈

9、更換色譜柱

10、維修或更換混合器，在流動(dòng)相不走梯度時(shí)，建議不使用泵的混合裝置

在下期內(nèi)容中，我們將繼續(xù)對(duì)出現(xiàn)保留時(shí)間漂移、鬼峰、峰拖尾、倒峰等問題的原因以及實(shí)驗(yàn)室常用脫氣方法、評(píng)價(jià)色譜柱的基本指標(biāo)等內(nèi)容進(jìn)行解析，敬請(qǐng)期待哦~

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