參與評(píng)論

評(píng)論

登錄后參與評(píng)論

全部評(píng)論(1條)

• 

  惟惜戀鬼飄飄 2016-12-01 00:00:00

  　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction ， PCR）是體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)。它與分子克隆和DNA序列分析方法幾乎構(gòu)成了整個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)。在這三種技術(shù)中，PCR方法理論上出現(xiàn)Z早，實(shí)踐中應(yīng)用也Z廣泛。PCR技術(shù)使對(duì)微量的核酸（DNA或RNA）操作變得簡(jiǎn)單易行，同時(shí)還可以使核酸研究脫離活體生物。PCR技術(shù)的發(fā)明是分子生物學(xué)的一項(xiàng)革命，它極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 　　PCR技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史 　　人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年Z早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒(méi)有任何實(shí)際意義。 　　1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過(guò)兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的diyi篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 　　但是，Z初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過(guò)對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。 　　PCR技術(shù)的基本原理和操作 　　1. PCR的基本原理 　　PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過(guò)不斷重復(fù)這一過(guò)程，可以使目的DNA片段得到擴(kuò)增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作為模板，因而PCR技術(shù)可使DNA的合成量呈指數(shù)型增長(zhǎng)。 　　2. PCR的基本成分 　　PCR包括7種基本成分：模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸（dNTP）、二價(jià)陽(yáng)離子、緩沖液及一價(jià)陽(yáng)離子。 　　模板DNA：包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、預(yù)先擴(kuò)增的DNA、cDNA和mRNA分子等幾乎所有形式的DNA和RNA都能成為PCR技術(shù)反應(yīng)的模板。除此之外，PCR反應(yīng)還可以直接以細(xì)胞為模板。 　　特異性引物：是一段與模板DNA鏈結(jié)合的寡核苷酸片段，對(duì)于DNA的擴(kuò)增起到引發(fā)的作用。 　　熱穩(wěn)定DNA聚合酶：這是PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的關(guān)鍵。熱穩(wěn)定DNA聚合酶是從兩類微生物中分離的：一類是嗜熱和高度嗜熱的真細(xì)菌，另一類是嗜熱古細(xì)菌。現(xiàn)在又出現(xiàn)了一種兼顧了幾種DNA聚合酶特點(diǎn)的混合型酶。 　　脫氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 　　二價(jià)陽(yáng)離子：常用到Zn2+和Mg2+，作為構(gòu)成熱穩(wěn)定性DNA聚合酶的成分之一。 　　緩沖液：一般使用Tris-Cl緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)的為10mmol/L，并將其調(diào)節(jié)到8.3~8.8之間。 　　一價(jià)陽(yáng)離子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善擴(kuò)增的產(chǎn)物質(zhì)量。 　　PCR的基本操作 　　PCR是一種級(jí)聯(lián)反復(fù)循環(huán)的DNA合成反應(yīng)過(guò)程。PCR技術(shù)的基本反應(yīng)由三個(gè)步驟組成： 　　1. 變性：通過(guò)加熱使模板DNA完全變性成為單鏈，同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除； 　　2. 退火：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合； 　　3. 延伸：將溫度升高，熱穩(wěn)定DNA聚合酶以dNTP為底物催化合成DNA鏈延伸。 　　以上三部為一個(gè)循環(huán)，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)后即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。 　　PCR的主要應(yīng)用 　　Z初建立PCR是為了擴(kuò)增已知序列的靶基因。因?yàn)樵赑CR方法問(wèn)世以前，要獲得一個(gè)靶基因，必須建立基因文件庫(kù)，然后從成千上萬(wàn)的菌落中通過(guò)Southern blot 雜交篩選含有靶基因的克隆。這樣既費(fèi)時(shí)又費(fèi)錢(qián)，特別是在克隆真核生物基因時(shí)難度更大。自從建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因變得非常容易。為了適應(yīng)分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR方法也得到了不斷發(fā)展，現(xiàn)在PCR已應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。 　　1. 基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用 　　目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說(shuō)幾乎沒(méi)有一個(gè)分子生物學(xué)家沒(méi)有使用過(guò)PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的： 　　l 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； 　　l 克隆基因； 　　l 基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； 　　l 基因組測(cè)序； 　　l 制備單鏈模板； 　　l 致突變； 　　2. PCR在臨床上的應(yīng)用 　　l 在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來(lái)檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。 　　l 在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與ZL的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及LX評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)ZL方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。 　　l 檢測(cè)病原體 　　l 在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism，PCR-SSOP）對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。 　　3. 在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 　　例如：Z早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來(lái)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對(duì)高度降解材料的檢測(cè)。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat，VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。 　　所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面。可以說(shuō)，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

  贊(17)

  回復(fù)(0)

  評(píng)論

  評(píng)論

  登錄后參與評(píng)論