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  YANYI雁翼 2006-04-17 00:00:00

  蛋白質(zhì)、酶和核酸這三大類物質(zhì)都是生物大分子，它們都具有十分重要的生理功能。酶是生物催化劑，核酸是遺傳信息的攜帶者，蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。因此對生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究，具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。而這研究的首要條件是制備高純度的生物大分子，否則對其結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。 2．制備方法的分類： 依理化性質(zhì)，分離、純化生物大分子的方法可分四個(gè)類型： (1)按分子大小和形態(tài)：采用高速離心、過濾、分子篩、透析等方法。 (2)按溶解度：采用鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配、結(jié)晶等方法。 (3)按電荷差異：采用電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、吸附層析等方法。 (4)按生物功能專一性：采用親和層析法。 3．制備的總體思路： 一般可分為六個(gè)階段： (1)材料選擇與預(yù)處理：動物、植物和微生物都是制備生物大分子的材料，選什么材料主要依靠實(shí)驗(yàn)的目的而定，選材料時(shí)應(yīng)注意以下幾個(gè)問題： ①使用的目的：從科學(xué)實(shí)驗(yàn)的特殊需要出發(fā)，選材時(shí)需求能符合實(shí)驗(yàn)預(yù)定目標(biāo)即可。 ②材料的生理狀態(tài)差異：選材時(shí)要注意植物的季節(jié)性，微生物的生長期和動物的生理狀 態(tài)。如：微生物生長的對數(shù)期，酶與核酸的含量較高。 材料選定后，通常要進(jìn)行預(yù)處理，如動物組織要剔除結(jié)締組織，脂肪組織等非活性部位，植物種子先行去殼、除脂、微生物需將菌體和發(fā)酵液分離開，暫時(shí)不用材料尚需冰凍保存。 （2）細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離 ①細(xì)胞的破碎：除了提取液和細(xì)胞外某些多肽激素、蛋白質(zhì)和酶不需破碎細(xì)胞膜，對于細(xì)胞內(nèi)和多細(xì)咆生物組織中各種生物大分子的分離提純都需要事先將細(xì)胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，不同生物體，或同一生物體的不同組織，其細(xì)胞破碎難易不一致，因此使用方法也不完全相同，通常兩種方法共同使用。 A． 高速組織搗碎機(jī) 玻璃勻漿器 研磨 機(jī)械切力的作用 物理方法： 反復(fù)凍融法 冷熱交替法 超聲波處理法 加壓破碎法 物理因素的作用 B．化學(xué)及生物化學(xué)法 自溶法 溶菌酶處理法 表面活性劑處理法 改變細(xì)胞膜透性法 但是，不管采用哪種方法，都需要在一定稀鹽溶液或緩沖溶液中進(jìn)行，且需加某些保護(hù)劑，以防止生物大分子的變性及降解。 ②細(xì)胞器的分離：制備某種生物大分子時(shí)，往往需要采用細(xì)胞中某一部分為材料；或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，通常破碎細(xì)胞后，先分離各組分，以防干擾，這對制備—些高難度和高純度的生物大分子是必要的，細(xì)胞器的分離，一般采用差速離心法，此法是利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，在離心管不同區(qū)域沉降的原理，分離出所需組分，分離得到的細(xì)胞器，其純度可采用電子顯微鏡法、免疫學(xué)法或測定標(biāo)志酶活力法進(jìn)行鑒定。 (3)提?。? 提取又稱抽提或萃取，其作用是將經(jīng)過處理或破碎了的細(xì)胞置于一定的條件和溶劑中，讓被提取的生物大分子充分地釋放出來，提取效果如何，取決于該物質(zhì)在溶劑中溶解度的大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用溶劑的理化性質(zhì)。原則地說，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性有機(jī)溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中；溫度高時(shí)，一般溶解度相應(yīng)增大，在遠(yuǎn)離生物大分子等電點(diǎn)的pH值時(shí)溶解度增加，從細(xì)胞中提取生物大分子也受擴(kuò)散作用的影響和分配定律的支配。由于影響因素較多，在實(shí)際制備時(shí)應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)條件靈活地加以應(yīng)用。 (4)分離純化 從細(xì)胞中提取出來的生物大分子是不夠純凈的，常含許多同類的或異類的物質(zhì)，必需進(jìn)一步分離純化才能獲得純品。生物大分子制備工作中，分離純化這一步既重要又復(fù)雜，主要方法可歸納為兩類： ①對異類物質(zhì)的分離：常采用專一性酶水解，有機(jī)溶劑抽提，選擇性分部沉淀和液固相轉(zhuǎn)化透析分離等方法。 ②對同類物質(zhì)的分離：常采用鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀、結(jié)晶、電泳、超離心、柱層析和吸附等方法。 (5)濃縮與結(jié)晶 ①濃縮是指低濃度溶液通過除去溶劑(包括水)變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程，常在提取后結(jié)晶 前進(jìn)行，有時(shí)也貫穿在整個(gè)制備過程中。濃縮的方法常采用： A．蒸發(fā)法：薄膜蒸發(fā)濃縮，減壓加溫蒸發(fā)濃縮，空氣流過蒸發(fā)濃縮。 B．冰凍法。 C．吸收法。 D．超濾法。 ②結(jié)晶是指使溶質(zhì)呈晶態(tài)從溶液中析出的過程。結(jié)晶除作為生化制備一種純化手段外，其結(jié)晶化合物還常常是生物大分子結(jié)構(gòu)的分析研究的材料，常用以下幾種方法進(jìn)行結(jié)晶。 A，鹽析法：加固體鹽法、加飽和鹽溶液法、透析法。 B．有機(jī)溶劑法。 C．等電點(diǎn)法。 D．脫鹽結(jié)晶法。 E．加金屬離子結(jié)晶法。 (6)干燥與保存： 干燥是指將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分(或溶劑)蒸發(fā)除去的過程，Z常用的方法是真空干燥和冷凍干燥。 保存是指樣品如何存放的問題，保存方法與生物大分子的穩(wěn)定性密切相關(guān)，常采用干態(tài)貯藏和液態(tài)貯藏的方法。干態(tài)貯藏法就是將干燥后的樣品置于干燥器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封，保持0—4℃冰箱中即可；液態(tài)儲藏法，首先免去煩雜的干燥過程，生物大分子的活性和結(jié)構(gòu)破壞較少，但應(yīng)注意樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝儲藏，必需加入防腐劑和穩(wěn)定劑。常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等。另外要求儲藏溫度較低，大多數(shù)在0℃左右冰箱保存，有的則要求更低的溫度。但不管采用哪種方法，都必須避免長期暴露在空氣中，以防微生物的污染。 (二)鑒定 經(jīng)過一系列的分離純化，所得到的物質(zhì)是不是我們所需要的，樣品的純度如何，都需要進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，包括純度鑒定、性質(zhì)與功能鑒定，結(jié)構(gòu)鑒定等，鑒定的方法也很多，具體實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)研究的需要選擇某些方法。 1．純度鑒定 (1)電泳法：純的蛋白質(zhì)、核酸樣品在它穩(wěn)定的范圍內(nèi)，在一系列不同的PH條件下進(jìn)行電泳時(shí)，都以單一的泳動速度移動，因此在區(qū)帶電泳中，它的電泳圖譜只有一個(gè)條帶，蛋白質(zhì)一般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋纖薄膜電泳等，核酸樣品一般采用瓊脂糖電泳。 (2)沉降分析法：純的蛋白質(zhì)、核酸樣品在離心力的影響下，以單一的沉降速度運(yùn)動，離心后只能得到一個(gè)條帶。 (3)恒溶度法：純的蛋白質(zhì)在一定的溶劑系統(tǒng)中具有恒定的溶解度，而不依賴于存在于溶液中未溶解固體的數(shù)量。在嚴(yán)格規(guī)定的條件下，以加入的固體蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，以溶解的蛋白質(zhì)的量為縱座標(biāo)作圖，如果蛋白質(zhì)樣品是純的，那么溶解度曲線只呈現(xiàn)一個(gè)折點(diǎn)，在折點(diǎn)之前，直線的斜率為l，在折點(diǎn)以后，斜率為零，不純的蛋白質(zhì)的溶解度曲線常常呈現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的折點(diǎn)。 2．性質(zhì)與功能鑒定 (1)分子量測定：蛋白質(zhì)、核酸樣品都可以通過適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法，測定出樣品的分子量。蛋白質(zhì)可以采用滲透壓法、沉降分析法、通透層析法、SDS-PAGE電泳法等，核酸樣品可采用瓊脂糖電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。 (2)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定：可通過等電聚焦電泳法。 (3)功能鑒定：具有酶或激素性質(zhì)的樣品可以利用它們的酶活性或激素活性來測定含量， 而不具有酶或激素活性的蛋白質(zhì)，可以先用來免疫適當(dāng)動物，一般會產(chǎn)生抗體，利用抗原—抗體反應(yīng)，也可以測定某一特定蛋白質(zhì)的含量，這些生物學(xué)方法的測定和總蛋白質(zhì)測定配合起來，可以用來研究蛋白質(zhì)分離過程中某一特定蛋白質(zhì)的提純程度，提純程度常用這一特定成分與總蛋白之比來表示，提純工作一直要進(jìn)行到這個(gè)比例不再增加為止。 3．結(jié)構(gòu)鑒定 (1)末端測定：可采用DNS—氨基酸或DNP—氨基酸聚酰胺薄膜層析法測定。 (2)組成分析：把樣品完全水解后進(jìn)行氨基酸或核苷酸的組成分析，并計(jì)算出各種氨基酸或核苷酸的分子比。 (3)“指紋”分析：將制備的樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品在相同條件下用蛋白酶或核酸內(nèi)切酶進(jìn)行部分水解，再進(jìn)行電泳，通過電泳圖譜的比較，可以判斷所分離到的樣品是否是所需要的成分。 (4)序列測定。 (5)探針技術(shù)：把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用已放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的針對特定氨基酸序列或核苷酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。探針技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，而且樣品無需經(jīng)過復(fù)雜的分離純化即可進(jìn)行鑒定，因此在分子生物學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。目前主要有三種技術(shù)： ①Southern blotting：1975年由Southern提出的轉(zhuǎn)移技術(shù)，通常用來對DNA特定序列進(jìn)行定位、鑒定。先將DNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持體(通常是硝酸纖維膜或尼龍膜)上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過程中，各個(gè)DNA片段的相對位置保持不變，用放射性標(biāo)記的DNA或RNA片段作為探針與固著在固相支持體上的DNA進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影后可以確定與探針互補(bǔ)的DNA片段的電泳條帶的位置。 ②Northern blotting：1977年由Alwine等提出的轉(zhuǎn)移技術(shù)，可用于測定總RNA或poly (A)+RNA樣品中特定mRNA分子的大小和豐度。 RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中按其大小不同而相互分離，隨后將RNA轉(zhuǎn)移至活化纖維素、硝酸纖維膜、玻璃或尼龍膜，用放射性標(biāo)記的與待測RNA分子互補(bǔ)的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交和放射自顯影，以對待測的RNA分子進(jìn)行作圖。 ③Western blotting：1979年由Towbin等人提出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移技術(shù)，用于對非放射性標(biāo) 記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特定蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒別和定量。通常使用的探針是抗體，它可與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)，先將待測樣品溶于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后被轉(zhuǎn)移到固相支持體上(常用硝酸纖維濾膜)然后可被染色，隨后濾膜可與抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體反應(yīng)，Z后結(jié)合上的抗體可用多種放射性標(biāo)記或酶偶聯(lián)的二級免疫學(xué)試劑進(jìn)行檢測。

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