為什么跨越內(nèi)含子就能避免基因組污染

留親斤 2017-04-10 01:30:04 616 瀏覽

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我前天訂的 2017-04-11 00:00:00

基因組污染產(chǎn)生比目的擴增產(chǎn)物更大的產(chǎn)物，原因是包含了兩段外顯子中間的內(nèi)含子，要想判斷雜帶是否為基因組污染引起，只需將外顯子+內(nèi)含子是否=雜帶分子量或者借用無基因組污染的cDNA模板擴增跑電泳（done）2、qPCR擴增時，引物擴增效率默認(rèn)為2，當(dāng)引物擴增效率低時（表現(xiàn)為pcr擴增電泳條帶亮度低），會影響結(jié)果上下調(diào)判斷，可以通過稀釋5個梯度，制作校正曲線來校正。3、RNA提取有基因組污染，會影響qPCR結(jié)果嗎？如何影響？如何去除基因組污染（done）所謂的跨內(nèi)含子引物，故名思意就是這一對引物跨過一個內(nèi)含子，我們知道真核生物基因組上的基因是有內(nèi)含子和外顯子組成的，而外顯子被內(nèi)含子說分隔開，但是內(nèi)含子是不轉(zhuǎn)錄成mRNA的。這就是真核細(xì)胞內(nèi)DNA和mRNA的區(qū)別，而我們一般用于檢測目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平時，使用RT-PCR或者realtime PCR，常常需要針對基因設(shè)計一對對的引物，一般來講，在提取RNA的過程中，會帶有基因組DNA的污染，所以，對于原核生物必須經(jīng)過DNase酶消化去除DNA，而真核生物由于內(nèi)含子的存在，我們可以設(shè)計引物分別在相鄰的兩個外顯子上，這樣DNA因為引物中間加了一個很大的內(nèi)含子，而常常無法P出條帶或者預(yù)計大小的條帶，而RNA反轉(zhuǎn)錄后的目的條帶是我們預(yù)期的，這樣就可以免去DNA消化的步驟，通過設(shè)計這種跨內(nèi)含子的引物來排除DNA的干擾，但是，并不是每個基因都能找到合適的引物在相鄰的且大小合適的外顯子上，所以，經(jīng)常也會在一個外顯子上設(shè)計引物，這時候就需要完全消化DNA才能得到可靠的結(jié)果4、axygen 品牌的槍頭和EP 管有無滅酶？（done 均滅酶）5、如果引物設(shè)計跨越了內(nèi)含子，是否可以忽略?基因組污染？（done）1）每個引物本身在兩個不同的引物上引物若跨內(nèi)含子的話，引物僅能以3'端的一小部分結(jié)合基因組DNA，這樣的話Tm會很低。在較高的退火溫度下，引物幾乎無法和基因組DNA結(jié)合來引發(fā)聚合，而主要是與能夠完全配對的cDNA結(jié)合并引發(fā)反應(yīng)。2）上下引物，分別位于兩個不同的外顯子上從cDNA和基因組擴增出來的片段大小不同，從而可以通過用合適的延伸時間來限制基因組中大片段的擴增，消除基因組的DNA污染。

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無處不在的PCR污染，如何有效避免？

前言

在PCR檢測過程中，不可否認(rèn)的是，沒有任何檢測是100%準(zhǔn)確的，比如我們可能也曾聽過假陽性這個名詞，那為什么會出現(xiàn)假陽性呢?這其實跟實驗操作過程造成的污染相關(guān)，在實驗開展過程中，主要有4種污染途徑：標(biāo)本間交叉污染、PCR試劑污染、PCR擴增產(chǎn)物污染、實驗室克隆質(zhì)粒污染。

如何對污染進行監(jiān)測？

1. 陽性對照

在建立PCR實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否符合理論要求的一個重要的參考標(biāo)志，陽性對照要選擇擴增度中等、復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)，但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大，因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。

2. 陰性對照

每次PCR試驗務(wù)必做陰性對照，它包括：①標(biāo)本對照，被檢標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清做對照，被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞做對照；②試劑對照，在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以檢測試劑是否污染。

3. 重復(fù)性實驗

4. 選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增

如何避免PCR污染？

實驗室防污染是重中之重，畢竟影響最終檢測結(jié)果，那么我們有哪些防污染的方法呢？

除了注意避免人工操作引入的污染，我們在實驗時應(yīng)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增帶的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)由一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。同時減少PCR循環(huán)次數(shù)，PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。

2023-01-03 16:11:31 245 0