什么是核酸檢測？

核酸檢測是指通過特殊的技術(shù)手段檢測臨床樣本中是否存在特定的病原體核酸，從而診斷患者的感染原因。新型肺炎核酸檢測主要是看它的核酸，通過實時聚合酶鏈反應(yīng)，即RT-PCR方法來檢測。檢測的樣本鼻拭子或咽拭子從鼻腔或者口腔用棉簽沾取樣本再出來做一個檢測，這是目前簡單、快捷的一個方法。

核酸檢測中病毒滅活樣本保存液的優(yōu)勢是什么呢？

1.降低RNA降解造成假陰性

核酸樣本保存條件苛刻，RNA極易裂解，4℃僅可存放24h，運輸過程過長RNA就會出現(xiàn)提前被降解的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致檢測假陰性增多。病毒樣本保存液是采樣管內(nèi)一種病毒樣本保護(hù)性運輸介質(zhì)，防止病毒采樣后不能及時檢測在送檢過程中病毒降解，避免因病毒在檢測途中提前降解造成假陰性。

2.減小核酸提取過程的感染

所有人都知道新冠肺炎的傳染性高，檢測過程中稍有不慎會被感染。核酸檢測需要有專門的儀器和標(biāo)準(zhǔn)的分子檢測實驗室，需要PCR認(rèn)證人員操作，步驟繁瑣，全程需要5~8個小時，過程中感染風(fēng)險大。

病毒滅活樣本保存液采用裂解鹽可以快速對呼吸道病原體進(jìn)行滅活、保存，使樣品失去感染性。由于是滅活病毒而不用培養(yǎng)病毒，首先需要的就是對病毒進(jìn)行裂解失活、破壞其膜蛋白釋放核酸，大大降低了核酸提取過程中被感染的危險度。

德晟研發(fā)生產(chǎn)的病毒樣本保存液分為病毒滅活樣本保存液和非滅活型，非滅活型病毒樣本保存液可以完整保護(hù)好病毒的蛋白，可用于細(xì)胞培養(yǎng)。針對不同的需求所適用的病毒樣本保存液也會有所不同，有需求的可直接來電咨詢。

根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》通知，“人群篩查應(yīng)選擇具有病毒滅活功能，如含胍鹽（異硫氰酸胍或鹽酸胍等）或表面活性劑的采樣管。”

滅活型病毒采樣管可高效滅活病毒，保護(hù)病毒核酸不被降解，且能在常溫下保存較長時間，為樣品保存及運輸節(jié)省成本。選擇滅活效果好的病毒采樣管，有助于確保后續(xù)核酸檢測質(zhì)量。

本期實驗，我們選取逗邦?一次性使用病毒采樣管進(jìn)行滅活效果測試，過程如下：

?

實驗材料

病毒采樣管：

逗邦?一次性使用病毒采樣管（滅活型）

實驗材料：

慢病毒（吉凱基因，GCNL0319432），HEK293T細(xì)胞

核酸提取試劑盒和提取儀：

逗邦?（BNP027-2B, M32)

新冠熒光PCR試劑盒：

圣湘（N083-5X0001）

逗邦?一次性使用病毒采樣管（滅活型）

?

實驗方法

參考《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）病毒滅活試驗中描述的檢測方法，確定病毒保存管滅活能力。

步驟一：細(xì)胞培養(yǎng)

將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至1×104/mL，按照100μL/孔的體積，每個梯度的病毒做三個復(fù)孔，計算所需接種孔數(shù)，將細(xì)胞緩慢均勻接種至96孔板中。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

步驟二：慢病毒稀釋

將病毒滴度為107-108TU/mL的慢病毒按10倍梯度進(jìn)行稀釋，連續(xù)稀釋3個梯度。

步驟三：病毒滅活

把稀釋好的病毒置于室溫條件下，與滅活款病毒保存液（批號：220201/220207/220211）按1:1體積比進(jìn)行混合，置于室溫下分別放置1min、5min和10 min進(jìn)行滅活。

步驟四：終止滅活

采用病毒分離培養(yǎng)基（可用DMEM完全培養(yǎng)基替代）進(jìn)行1000倍稀釋以中和滅活保存液，終止滅活。

陰性對照：為病毒分離培養(yǎng)基對滅活款病毒保存液稀釋1000倍的混合液；

陽性對照：為病毒分離培養(yǎng)基對病毒原液稀釋1000倍的混合液。

步驟五：病毒孵育

將事先培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100μL準(zhǔn)備好的病毒混合液，和對應(yīng)的陽性對照、陰性對照。病毒孵育3小時，每隔30分鐘從培養(yǎng)箱中取出晃動一次。

步驟六：細(xì)胞培養(yǎng)

孵育結(jié)束后，將病毒液吸去，每孔中加入100μL DMEM完全培養(yǎng)基，將96孔板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞狀態(tài)。

步驟七：熒光細(xì)胞觀察與計數(shù)

繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，期間觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)液變黃，應(yīng)換液，對熒光細(xì)胞個數(shù)適量的孔進(jìn)行計數(shù)，計算病毒滴度。

?

實驗結(jié)果

圖1：三批次滅活款病毒保存管在病毒滅活

不同時間后細(xì)胞生長情況

表1：三批次滅活款病毒保存管在病毒滅活

不同時間后病毒滴度情況

?

實驗結(jié)論

由圖1和表1數(shù)據(jù)可以看出，慢病毒經(jīng)滅活1min、5min和10min后感染HEK293T細(xì)胞后，在顯微鏡明場下細(xì)胞生長正常；三批次的滅活款病毒保存管與病毒作用5min后，可以有效滅活病毒。