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  瓊樓玉YU8987 2009-03-09 00:00:00

  兩種藥物代謝酶活性測定 一、 DDPH對大鼠肝臟微粒體CYP450及Ⅱ相結(jié)合酶活性的影響 材料和方法 1 材料 1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體重220±20 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物ZX提供。 1.2 儀器設(shè)備 Mettler AE200電子天平（Mettler Toledo公司） 161F 4℃冰箱（美菱公司） SANYO 醫(yī)用低溫冰箱（-30℃）（Sanyo公司） 8525超低溫冰箱（-70℃）（Forma Scientific公司） 3-18K高速低溫離心機（Sigma公司） TGL-16G臺式高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠） PB-20 pH計（Sartovius公司） F-4500熒光分光光度計（Hitachi公司） ELX800uv酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司） SPD-10AGX液相色譜儀系統(tǒng)（包括LC-10ADvp輸液泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-10A紫外檢測器，Shimadzu公司） HITACHI L2100GX液相色譜儀系統(tǒng)（包括L2100四元梯度泵、L2200自動進樣器、L2300熒光檢測器，Hitachi公司） N2000色譜工作站（浙江大學(xué)智達信息工程有限公司） DKZ-450B型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司） 722s可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司） DY89-II型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司） UPH-IV-10T型超純水機（上海優(yōu)普實業(yè)有限公司） 1.3 藥品與試劑 DDPH（純度≥99.5%，ZG藥科大學(xué)提供）；Tris-base為Roche公司產(chǎn)品；氧化型輔酶Ⅱ（NADP），葡萄糖6-磷酸脫氫酶，6-磷酸葡萄糖二鈉，紅霉素（Erythromycin），甲氧基異惡唑（Methoxyresorufin），乙氧基異惡唑（Ethoxyresorufin），戊氧基異惡唑（Pentoxyresorufin），異惡唑（Resorufin），甲苯磺丁脲，4-羥基甲苯磺丁脲，對羥基聯(lián)苯（p-Pheylpohenol），還原型谷胱甘肽（GSH），UDPGA，β萘黃酮均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為Pierice公司產(chǎn)品；地塞米松磷酸鈉注射液（5 mg•mL-1），江蘇漣水制藥有限公司生產(chǎn)；注射用苯鈉（0.1 g），上海新亞有限公司生產(chǎn)；鹽酸苯胺，4-氨基酚，氫溴酸右美沙芬，O-去甲基右美沙芬，普萘洛爾，1-氯2，4-二硝基苯（CDNB），硫酸奎寧，苯酚，硫酸鋅，三氯醋酸，高氯酸，氯仿，甲醛，乙酰丙酮，乙腈，甲醇，醋酸等及其他無機和有機試劑均為國產(chǎn)分析純。 2 方法 2.1 動物分組及給藥 將實驗大鼠隨機分成以下組，每組6～8只。 分組情況 所給藥物及組別 給藥劑量 給YF式 給藥時間 藥物組 DDPH（低劑量組） 12.5 mg/kg/d ig，bid 連續(xù)7 d DDPH（中劑量組） 25 mg/kg/d ig，bid 連續(xù)7 d DDPH（高劑量組） 50 mg/kg/d ig，bid 連續(xù)7 d 對照組 0.5%羧甲基纖維素鈉 10.0 mL/kg/d ig，bid 連續(xù)7 d 地塞米松組 地塞米松磷酸鈉注射液 （CYP3A陽性對照組） 75 mg/kg/d ip 連續(xù)4 d 苯組 注射用苯鈉 （CYP2B陽性對照組） 80 mg/kg/d ip 連續(xù)3 d β萘黃酮組 β萘黃酮 （CYP1A1/2陽性對照組） 80 mg/kg/d ip 連續(xù)3 d 乙醇組 25%乙醇 （CYP2E1陽性對照組） 10 mL/kg/d ig 連續(xù)7 d 2.2 肝微粒體的制備 采用鈣沉淀法制備肝微粒體[27]。 各處理組大鼠末次給藥后，禁食不禁水，24 h后斷頭處死。迅速打開腹腔和胸腔，作門靜脈插管，剪斷下腔靜脈，用注射器吸取預(yù)冷的生理鹽水自門靜脈沖洗肝臟至土黃色。將肝臟剪切至適量大小組織塊，用濾紙吸干表面水分，稱重。按1∶4（W/V）比例加入勻漿緩沖液（50 mmol•L-1 Tris-1.15% KCl，pH＝7.4）勻漿后于4℃下12 000 g離心20 min。取上清液，按10∶1（V/V）比例加入相應(yīng)量的88 mmol•L-1 CaCl2，混勻，冰浴5 min。4℃下，27 000 g離心15 min，得粉色半透明沉淀，即為肝臟微粒體。沉淀沖洗一次，重懸浮于0.25 mol•L-1蔗糖溶液中，分裝，于-70℃儲存待測。 2.3 肝微粒體蛋白含量測定 蛋白含量測定采用BCA法，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，參照試劑盒說明書操作。 （1）取試劑A與試劑B，按A∶B=50∶1（V/V）比例，充分混勻，得BCA工作液。 （2）取BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用超純水稀釋得到2，1.5，1，0.75，0.5，0.25 mg•mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液。 （3）取適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品，按1∶20（V/V）加入工作液，充分混合。 （4）37℃溫孵30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至96孔板，ELX800uv酶標(biāo)儀測定540 nm處吸光度值。 （5）按所得蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算肝微粒體樣品混懸液蛋白濃度。 2.4 細(xì)胞色素P450酶學(xué)分析 2.4.1 CYP450總酶含量測定 采用Omura和Sato的方法[28]測定CYP450總酶含量。 （1）取待測樣品用緩沖液稀釋得0.3～1 mg•mL-1的蛋白混懸液。 （2）加入連二亞硫酸鈉2～3 mg，輕輕混勻。 （3）將樣品等量分裝入兩個比色杯中，樣品杯通入CO氣體約30 s，以氣泡連續(xù)，液體不溢出為好。 （4）將比色杯置于722s可見分光光度計中，以參照杯作為空白調(diào)零，測定樣品杯在450 nm和490 nm處吸光度值（分別為A450和A490）。按以下公式計算CYP450總酶含量： 2.4.2 乙氧基異惡唑O-脫乙基酶（Ethoxyresorufin O-deethylase，EROD），甲氧基異惡唑O-脫甲基酶（Methoxyresorufin O-demethylase， MROD）及戊氧基異惡唑O-脫烷基酶（Pentoxyresorufin O-dealkylase， PROD）活性測定 EROD，MROD及PROD活性根據(jù)熒光法以Resorufin為標(biāo)準(zhǔn)品，在熒光分光光度計上測定[29]。 基本原理： Resorufin在激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為585 nm時有Z大熒光吸收峰。 （1）試劑配制：1 mmol•L-1 Methorxyresorufin；1 mmol•L-1 Ethorxyresorufin；1 mmol•L-1 Pentoxyresorufin（均溶于DMSO）；50 mmol•L-1 Tris-25 mmol•L-1 MgCl2，pH＝7.4；10 μmol•L-1 Resorufin。 （2）取2.5 mg•mL-1微粒體蛋白60 μL，加入1 mmol•L-1的底物6 μL，Tris-MgCl2緩沖液加至570 μL，Z后加入NAPDH生成體系30 μL，在37℃水浴振搖孵育5 min。 （3）加入1 mL甲醇終止反應(yīng)，于3 000 g下離心10 min。 （4）取上清液置熒光分光光度計于激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為585 nm下測定其熒光強度值。由Resorufin標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計算MROD、EROD、PROD酶活性： 標(biāo)記一 2.4.3 甲苯磺丁脲羥基酶（Tolbutamide hydroxylase，Tol-hydroxylase）活性測定 Tol-hydroxylase 活性采用反相GX液相紫外檢測法測定[30]。 （1）試劑配制：3 mmol•L-1甲苯磺丁脲；10 mmol•L-1 4-羥基甲苯磺丁脲；1 mmol•L-1 DDPH（溶于乙腈）；0.1 mol•L-1磷酸鉀緩沖液，pH＝7.4；10 mmol•L-1醋酸鈉緩沖液。 （2）取5 mg•mL-1微粒體蛋白50 μL，加入3 mmol•L-1甲苯磺丁脲10 μL，0.1 mol•L-1磷酸鉀緩沖液120 μL，蒸餾水10 μL，Z后加入NAPDH生成體系20 μL，在37℃水浴振搖孵育30 min。 （3）加入含有1 mmol•L-1 DDPH的乙腈溶液200 μL終止反應(yīng)。 （4）渦漩2 min，15 000 g離心5 min。 （5）取上清液20 μL進入HPLC系統(tǒng)測試分析。 （6）HPLC分析條件：Nucleodur C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈/10 mmol•L-1醋酸鈉緩沖液（37/63，V/V）；流速：1 mL•min-1；檢測波長：230 nm。 （7）由4-羥基甲苯磺丁脲的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計算酶活性： 標(biāo)記一2.4.3 右美沙芬O-脫甲基酶（Dextromethorphan O-demethylase，DXM O-demethylase）活性測定 DXM O-demethylase活性采用反相GX液相熒光檢測法測定[31]。 （1）試劑配制：100 μmol•L-1右美沙芬；4 μmol•L-1 O-去甲基右美沙芬；1.5 mg•L-1普萘洛爾（溶于乙腈）；0.1 mol•L-1磷酸鉀緩沖液，pH＝7.4；0.2% HAC（三乙胺調(diào)pH＝4.0）。 （2）取5 mg•mL-1微粒體蛋白20 μL，加入100 μmol•L-1右美沙芬25 μL，0.1 mol•L-1磷酸鉀緩沖液125 μL，蒸餾水30 μL，Z后加入NAPDH生成體系50 μL，在37℃水浴振搖孵育30 min。 （3）加入含有1.5 mg•L-1普萘洛爾的乙腈溶液250 μL終止反應(yīng)。 （4）渦漩2 min，15 000 g離心5 min。 （5）取上清液20 μL進入HPLC系統(tǒng)測試分析。 （6）HPLC分析條件：Nucleodur C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈/甲醇/0.2%HAC（pH＝4.0）（50/40/125，V/V/V）；流速：1 mL•min-1；熒光檢測波長：Ex=270 nm，Em=310 nm。 （7）由O-去甲基右美沙芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計算酶活性： 2.4.4 苯胺羥化酶（Aniline Hydroxylase，ANH）的活性測定 采用4-氨基酚形成法測定[32]。 （1）試劑配制：0.1 mol•L-1鹽酸苯胺；0.1 mol•L-1 Tris-0.3 mmol•L-1 KCl-20 mmol•L-1 MgCl2，pH＝7.4；50%三氯醋酸；5%三氯醋酸；5%苯酚（含2% NaOH）；1 mol•L-1 NaCO3；10 μmol•L-1 4-氨基酚。 加樣一覽表： 緩沖液 蒸餾水 微粒體 鹽酸苯胺 NAPDH 空白管 325 μL 25 μL 100 μL --- 50 μL 樣品管 325 μL --- 100 μL 25 μL 50 μL （2）按上表加樣，依次放入37℃水浴中振搖孵育30 min。 （3）加入預(yù)冷的50%三氯醋酸100 μL終止反應(yīng)。 （4）3 000 g離心15 min。 （5）取上清液350 μL加入5%苯酚50 μL混勻。 （6）加入1 mol•L-1 Na2CO3 100 μL混勻，于37℃水浴振搖孵育30 min，放置至室溫，置ELX800uv酶標(biāo)儀中測定630 nm處光密度值。 （7）由4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計算酶活性： 2.4.5 紅霉素N-脫甲基酶（Erythromycin N-demethylase，ERD）活性測定 采用Nash試劑-甲醛形成法測定[32]。 （1）試劑配制：50 mmol•L-1 Tris-1.15% KCl，pH=7.4；25% ZnSO4；飽和Ba(OH)2；NADPH生成體系（含4 mmol•L-1 NADP，10 mmol•L-1 葡萄糖6-磷酸二鈉，葡萄糖6-磷酸脫氫酶4 U•mL-1）；4 mmol•L-1紅霉素；3.33 mmol•L-1甲醛標(biāo)準(zhǔn)液；Nash試劑（取醋酸氨5 g，乙酰丙酮100 μL，3%醋酸6 mL，混勻）。 （2）按加樣一覽表加樣后（未加NADPH生成體系），依次放入37℃水浴中溫孵約1 min。 （3）預(yù)孵后依次加入NADPH生成體系啟動反應(yīng)，37℃水浴振搖孵育20 min（標(biāo)準(zhǔn)管在加入NADPH生成體系后10 min時加入3.33 mmol•L-1甲醛標(biāo)準(zhǔn)液）。 加樣一覽表： 緩沖液 蒸餾水 微粒體 紅霉素 NAPDH 甲醛標(biāo)準(zhǔn)品 空白管 250 μL 75 μL 100 μL --- 75 μL --- 標(biāo)準(zhǔn)管 250 μL 65 μL 100 μL --- 75 μL 10 μL 樣品管 250 μL 75 μL 100 μL 50 μL 75 μL --- （4）孵育結(jié)束后，依次加入25% ZnSO4 50 μL立即混勻后，終止反應(yīng)，然后每管加入飽和Ba(OH)2 50 μL，混勻。 （5）樣品于3 000 g下離心10 min。 （6）取上清液350 μL，加入150 μL Nash試劑，混勻后于50℃水浴振搖孵育30 min。孵育結(jié)束后，室溫冷卻，轉(zhuǎn)移至96孔板，ELX800uv酶標(biāo)儀測定其在420 nm處的光密度值。按以下公式計算酶活性： 2.5 Ⅱ相代謝酶活性分析 2.5.1 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathion S-transferase，GST）活性測定 參照文獻[33]方法測定。 試劑配制：50 mmol•L-1還原型谷胱甘肽；50 mmol•L-1 CDNB（溶于DMSO）；0.1 mol•L-1磷酸鉀緩沖液，pH=6.5。 加樣一覽表： 空白對照 樣品 0.1 mol•L-1磷酸鉀緩沖液（pH=6.5） 960 μL 950 μL 50 mmol•L-1還原型谷胱甘肽 20 μL 20 μL 50 mmol•L-1 CDNB 20 μL 20 μL 微粒體樣品 --- 10 μL （2）按上表加樣，Z后加入微粒體蛋白后迅速混勻，于340 nm處記錄單位時間光密度的變化。按下列公式計算GST含量： 2.5.2 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase UGT）活性測定 參照文獻方法測定[32]。 （1）反應(yīng)液中含微粒體蛋白0.25 mg，0.25% TritonX-100 10 μL，50 mmol•L-1 MgCl2 25 μL，5 mmol•L-1對羥基聯(lián)苯25 μL（溶于DMSO），1 mmol•L-1 Tris-HCl（pH7.4）25 μL，用雙蒸水補足至250 μL。空白管不加微粒體，用雙蒸水補足。 （2）反應(yīng)液在37℃水浴溫孵5 min后加入30 mmol•L-1 UDPGA 50 μL啟動反應(yīng)，繼續(xù)溫孵10 min。 （3）孵育結(jié)束后將樣品置冰浴上，加入10%過氯酸250 μL，氯仿1 mL終止反應(yīng)。 （4）振搖10 min，3 000 g離心5 min，取水相250 μL，加1.6 mol•L-1甘氨酸緩沖液（pH=10.3）1.75 mL，于激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長325 nm處測定熒光強度F，以硫酸奎寧作相對標(biāo)準(zhǔn)計算酶活性，按下列公式計算酶活性： （5）硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 取干凈的EP管，向管中分別加入100 mg•L-1奎寧100 μL，200 μL，400 μL，800 μL，再分別加入0.05 mol•L-1硫酸，使總體積為4 mL。混勻后在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長450 nm處測定樣品中的熒光強度，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的k值。 3 數(shù)據(jù)的處理和分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

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  wangbiaocooec 2009-03-05 00:00:00

  不能，先保肝，再抗結(jié)核ZL，2倍以上

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