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  lfv的春天 2017-01-21 00:00:00

  提取核酸時(shí)，加入蛋白酶后為什么要加熱到65攝氏度 請注意：SDS對于脫氧核糖核酸酶以及核糖核酸酶均有YZ作用. 這里提供的是由Marmur于1961年建立，經(jīng)Dale等人簡化和發(fā)展，此方法略加修改后可用于其他細(xì)菌種類.主要原理是：采用去垢劑破碎細(xì)菌細(xì)胞，酚－氯仿萃取蛋白，使用核糖核酸酶和蛋白酶K進(jìn)行進(jìn)一步的純化，所提取的DNA無RNA和蛋白質(zhì)污染，可用于限制性內(nèi)切酶消化，分子克隆. ⑴材料 ①20倍SSC緩沖液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸鈉；pH 7.0(高壓滅菌后，4攝氏度保存可長期使用) ②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸處理，市售的酚常含有雜質(zhì)而呈粉色和淡黃色，需要重蒸二次，收集沸點(diǎn)160℃部分，小瓶分裝，瓶內(nèi)空腔充氮?dú)?，?0℃密封保存，以免氧化，用前從冰箱中取出，68℃蒸餾水飽和，加入8—羥基喹啉（100g酚加0.1g），酚變?yōu)辄S色.8—羥基喹啉是抗氧化劑，并能部分YZ核糖核酸酶，含8—羥基喹啉的酚用等體積1.0mol/L pH 8.0Tris 緩沖液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巰基乙醇的Tris緩沖液抽提數(shù)次，酚溶液的pH應(yīng)大于7.6.此酚溶液在平衡緩沖液覆蓋下4℃可保存一個(gè)月，純化和制備酚溶液都要帶手套，以免損傷皮膚. ③核糖核酸酶：無DNA酶污染，將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，濃度為10mg/ml.于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝后于－20℃保存. ④蛋白酶K ⑤TES緩沖液：10mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA ⑵方法 ①取單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.（使用試管） ②將上述菌液接種于200mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.（使用500ml或1000ml三角瓶） ③離心，收集沉淀（5000r/m，10分鐘） ④將沉淀懸浮于20ml 20倍SSC緩沖液中，混勻. ⑤加入200mg SDS，室溫下振蕩過夜，使細(xì)菌細(xì)胞充分裂解，裂解液呈粘稠狀 ⑥加入等體積的酚/氯仿溶液，溫和地混勻，細(xì)心地回收上層水相（注意不要觸及二相之界面），重復(fù)萃取三次 ⑦加入2倍體積無水乙醇，此時(shí)可見到絮狀DNA沉淀或用玻璃棒繞取收集 ⑧將DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中，加入核糖核酸酶（Z終濃度50ug/ml），37℃保溫1小時(shí) ⑨加入蛋白酶K（50ug/ml），繼續(xù)保溫1小時(shí) ⑩加入等體積苯酚萃取一次，在回收的水相中加入2.5倍體積的無水乙醇，－20℃靜止過夜 25000g，4℃，離心15分鐘，收集沉淀，用－20℃無水乙醇洗滌一次；將DNA在真空干燥器中抽干，溶于10mlTES緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆?

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