2025年11月25日，中國科學院廣州地球化學研究所團隊在環(huán)境微生物學頂級期刊《The ISME Journal》上發(fā)表了題為：

“In situ degradation of 2-methylnaphthalene by a soil Penicillium strain associated with fungal-bacterial interactions”的研究論文。該研究首次結合單細胞拉曼激活細胞分選（RACS）與穩(wěn)定同位素探測（SIP）技術，成功從石油污染土壤中直接識別、分選并鑒定出一株能夠原位高效降解新型有機污染物（2-甲基萘）的青霉菌新菌株Penicillium sp. LJD-20，并揭示了其獨特的降解基因譜與潛在的真菌-細菌互作機制。

長光辰英核心產品——PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀為研究提供了關鍵的單細胞識別與分選平臺，通過精準捕獲代謝活性細胞，并結合基因組學分析，為深入解析真菌在環(huán)境污染修復中的功能與生態(tài)角色提供了強有力的技術支撐。

本研究旨在原位識別并表征能夠降解2-甲基萘的活性真菌，并闡明其降解機制。

1.樣品：采集勝利油田石油污染土壤，設置添加13C標記或未標記2-甲基萘的微環(huán)境體系，并添加抗生素抑制細菌活性，以聚焦于真菌的貢獻。

2.單細胞拉曼識別與分選（RACS）：單根真菌菌絲進行拉曼光譜采集。通過識別由13C摻入導致的特征峰位移（如蛋白質Amide III峰從1105 cm?1偏移至1082 cm?1），精準定位正在代謝污染物的活性真菌細胞。

3.活性細胞分選與測序：利用激光誘導向前轉移技術，將具有13C標記信號的單根活性真菌菌絲分選至收集管中，進行單細胞基因組擴增與測序。

4.DNA穩(wěn)定同位素探測驗證：對土壤總DNA進行密度梯度離心，分離輕重組分，通過測序驗證活性真菌在重DNA組分中的富集，并與RACS結果相互印證。

5.菌株培養(yǎng)與功能驗證：將分選得到的活性真菌單細胞進行培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株LJD-20，評估其在不同條件下的生長及對2-甲基萘的降解能力，并測定相關胞外酶活性。

6.基因組與代謝途徑分析：對單細胞基因組進行測序和功能注釋，鑒定與污染物降解相關的基因，并結合LC-MS/MS檢測的代謝中間產物，推測其可能的降解途徑。

1.基于¹³C位移的活性甲基萘降解微生物單細胞拉曼光譜分析

研究團隊利用單細胞拉曼光譜結合穩(wěn)定同位素標記技術，成功識別出在污染土壤中原位降解2-甲基萘的活性真菌細胞。實驗中使用13C標記的2-甲基萘作為底物?；钚越到饩诖x過程中會將13C同位素同化到自身生物分子中，導致其拉曼光譜發(fā)生特征性位移。在150根菌絲中，10根菌絲的拉曼光譜顯示出明顯的13C特征位移，這些位移在對照組的菌絲中完全不存在。在未標記的細胞中，Amide III蛋白譜帶位于約1105 cm?1。而在來自13C標記體系的活性降解細胞中，該譜帶明顯位移至1082 cm?1。

2.基于 DNA 穩(wěn)定同位素探針技術對原位活性甲基萘降解微生物的鑒定與驗證

通過拉曼光譜識別出的10根活性真菌菌絲，利用拉曼激活細胞分選（RACS） 技術進行精確分選。分選后的單細胞進行多重置換擴增（MDA），獲取足夠量的DNA用于測序。進行ITS基因測序以鑒定物種，并進行單細胞基因組測序以分析功能基因。ITS測序結果顯示，該活性真菌屬于青霉菌屬（Penicillium）。其ITS序列與已知菌株 Penicillium paxilli 的相似度為96.7%，低于界定物種的閾值（98.6%），因此被認定為一個未被報道過的新物種，命名為 Penicillium sp. LJD-20。在實驗體系中添加了抗生素以抑制細菌，SIP結果進一步證實：所有細菌類群的REF值均< 1.5，表明在本實驗條件下，細菌未直接參與2-甲基萘的降解，降解過程主要由真菌驅動。

該部分研究成功地將單細胞分選技術與群落水平同位素示蹤技術有機結合，不僅鑒定出一株新的活性降解真菌 Penicillium sp. LJD-20，更通過多重技術相互印證，構建了一個嚴謹、可靠的環(huán)境功能微生物鑒定與驗證范式，為復雜環(huán)境中微生物原位功能的解析提供了方法學典范。

圖2.利用拉曼激活細胞分選技術對功能性真菌細胞進行分離與系統(tǒng)發(fā)育分析

3.多視野成像的細胞計數及通過 D?O 探針評估酵母的代謝活性

為闡明通過RACS鑒定出的活性真菌降解菌對2-甲基萘的生物降解和生物強化機制，通過單細胞基因組測序并結合KEGG數據庫注釋，分析了其功能基因和潛在的代謝途徑。除了檢測到真菌中常見的細胞色素P450酶編碼基因（外，我們還鑒定出通常與細菌相關的、對芳香化合物降解至關重要的雙加氧酶基因。這些基因包括編碼環(huán)羥基化雙加氧酶（RHD）、芳香環(huán)開環(huán)雙加氧酶（AROD）以及醛脫氫酶（mIdD）的基因，其中mIdD是在甲基萘代謝過程中將2-萘甲醛轉化為2-萘甲酸的關鍵酶。

功能注釋和序列同源性表明，鑒定出的基因很可能來源于真菌。這些鑒定出的雙加氧酶此前未經過表征，但與已報道的蛋白質顯示出相對較強的氨基酸序列相似性。例如，RHD與來自青霉菌和曲霉的蛋白質分別具有78.3%和78.1%的序列相似性；AROD與來自不同青霉菌菌株的蛋白質分別具有76.7%、76.2%和73.6%的序列相似性。鑒定出的P450酶與先前表征的蛋白質氨基酸序列相似性低于83.4%，表明它們是已知P450家族中的分化同源物。

同樣，本研究觀察到的mIdD與其最相近的已知同源物序列相似性也低于80%。這些發(fā)現(xiàn)表明，降解甲基萘的菌株LJD-20擁有與有機污染物去除相關的基因所編碼的功能蛋白。

圖3.分離微生物的代謝潛力及其胞外酶分析

4.建立與驗證 CNN 模型用于酵母分類

通過LC-MS/MS分析，在LJD-20降解2-甲基萘的過程中，穩(wěn)定檢測到兩種主要中間代謝物為2-萘甲醇和2-萘甲醛，這兩種代謝物的出現(xiàn)，強烈提示存在一條以甲基末端氧化為主導的降解途徑。單細胞基因組分析進一步支持了這一代謝推斷，發(fā)現(xiàn)了一個類似 nidD 的基因，編碼醛脫氫酶。該酶很可能負責將2-萘甲醛進一步氧化為2-萘甲酸，從而在側鏈氧化過程中發(fā)揮關鍵作用。結合此前鑒定到的雙加氧酶基因，研究推測LJD-20可能具備雙途徑降解潛力：甲基末端氧化途徑（經2-萘甲醇、2-萘甲醛）和芳香環(huán)氧化裂解途徑（依賴雙加氧酶）。

本研究通過“代謝物-基因”雙維度證據鏈，首次系統(tǒng)推測了青霉菌LJD-20降解2-甲基萘的雙途徑代謝藍圖。這不僅在生化機制上深化了對真菌降解烷基化PAHs過程的理解，更重要的是從生態(tài)適應視角詮釋了真菌降解基因分布的進化意義。

本研究通過創(chuàng)新性地整合單細胞RACS-SIP技術與基因組學分析，建立了一套從復雜環(huán)境中直接“捕撈”并解析活性功能微生物的完整方法學體系。成功發(fā)現(xiàn)并證實了一株具有多重降解潛力的青霉菌新菌株LJD-20是2-甲基萘的原位降解者，并首次在單細胞水平上揭示了其與伴生細菌潛在的代謝互作藍圖。

該研究突破了傳統(tǒng)真菌生物修復研究的瓶頸，極大地拓展了對真菌代謝多樣性及其在環(huán)境污染修復中關鍵生態(tài)角色的認知，為開發(fā)基于真菌群落調控的新型生物修復策略提供了重要的理論與技術基礎。

羅春玲

博士，研究員。2006年，于香港理工大學獲博士學位。學科方向為環(huán)境有機地球化學。近期研究主要集中在有機污染物在土壤-植物系統(tǒng)的遷移轉化、土壤生物修復、污泥資源化利用。研究成果發(fā)表SCI刊物論文150余篇，論文被SCI引用5000余次，參與編寫論著3部，授權發(fā)明專利10余項。現(xiàn)任中國土壤學會土壤環(huán)境專業(yè)委員會委員、中國土壤學會國際合作專業(yè)委員會委員、中國環(huán)境科學學會新污染物治理專業(yè)委員會委員、廣東省可持續(xù)發(fā)展協(xié)會理事。曾入選中國科學院國外杰出人才引進計劃“百人計劃”（2010）、中組部“萬人計劃”青年拔尖人才（2017）、獲國家優(yōu)秀青年基金（2014）資助。

李繼兵

中國科學院廣州地球化學研究所副研究員，碩士生導師。2018年于中國科學院大學獲博士學位。曾獲廣東省杰出青年基金、廣州市科技菁英“領航”計劃。入選中國科學院廣州分院年度優(yōu)秀青年科技工作者、“中國科學院青年創(chuàng)新促進會”會員、“廣東省100位博士博士后創(chuàng)新人物”和“國家博士后創(chuàng)新人才支持計劃”，獲得中國科學院優(yōu)秀博士學位論文和中國科學院院長優(yōu)秀獎等。主要從事環(huán)境微生物技術和土壤有機污染，尤其是發(fā)展和利用穩(wěn)定同位素示蹤（SIP）-單細胞拉曼分選和分子生物學聯(lián)用技術，開展多環(huán)芳烴/石油烴及其衍生物等有機污染物的生物降解研究。相關成果發(fā)表SCI論文50余篇，第一/通訊作者SCI論文31篇，包括ISME J、Environmental Science & Technology、Water Research、Soil Biology and Biochemistry、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology等國際權威期刊論文，授權國內國際發(fā)明專利15件?，F(xiàn)任國際期刊《Resources, Environment and Sustainability》及《地球化學》青年編委。

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