難點一：復雜食品基質的干擾

難點二：免疫親和柱的性能控制與操作

難點三：痕量分析的實驗室控制與污染

難點四：儀器的高靈敏度要求

1.標準溶液配制

1.1 標準儲備液(100 mg/L):準確稱取雙酚A、雙酚F 和雙酚S標準品各10mg(精確至0.1mg),分別用甲醇溶解并定容至 100mL，混勻。將溶液轉移至棕色玻璃試劑瓶中,-18℃下避光保存,有效期為12 個月。

1.2 標準中間液(1mg/L):準確吸取雙酚A、雙酚F和雙酚S的標準儲備液各 0.10 mL,分別置于10mL,容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻。將溶液轉移至棕色玻璃試劑瓶中,-18 ℃下避光保存,有效期為6個月。

1.3 標準混合使用液(雙酚 A和雙酚F:100 μg/L;雙酚 S:10 μg/L):準確吸取雙酚 A 和雙酚F的標準中間液各 1.0mL、雙酚S的標準中間液 0.10mL,置于10mL,容量瓶中,用甲醇-水溶液(40+60)定容至刻度,混勻。臨用現配。

1.4 同位素內標中間液(1 mg/L):準確吸取¹³C12-雙酚A標準溶液、¹³C12-雙酚F標準溶液和¹³C12-雙酚 S標準溶液各 0.10 mL,分別置于 10 mL,容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻。將溶液轉移至棕色玻璃試劑瓶中,-18℃下避光保存,有效期為6個月。

1.5 同位素內標混合使用液(¹³C12-雙酚 A 和¹³C12-雙酚F:100 μg/L;¹³C12-雙酚 S:10 μg/L):準確吸取¹³C12-雙酚 A 和¹³C12-雙酚 F 中間液各 1.00 mL、¹³C12-雙酚S中間液 0.10 mL,置于10mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液(40+60)定容至刻度,混勻，臨用現配。

1.6 標準系列工作液:分別準確吸取標準混合使用液 0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、0.80 mL.1.00 mL、2.00 ml, 于 10 ml,容量瓶中,加人 0.50 mL,同位素內標混合使用液,用甲醇-水溶液(40+60)定容至刻度,混勻。標準系列工作液中雙酚A 和雙酚F的質量濃度分別為1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、8.00 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L,雙酚S的質量濃度分別為 0.100 μg/L、0.200 μg/L、0.500 μg/L、0.80μg/L、1.00μg/L、2.00 μg/L,¹³C12-雙酚 A和¹³C12-雙酚F的質量濃度為5.00μg/L,¹³C12-雙酚S的質量濃度為 0.500 μg/L。臨用現配。

2.前處理

2.1試樣提取

2.1.1 肉及肉制品、水產品、固態(tài)及半固態(tài)乳制品(乳粉、發(fā)酵乳等)、嬰幼兒配方食品

稱取1g試樣(精確至 0.01 g),置于50mL聚丙烯離心管中,加入50 μL同位素內標混合使用液,振蕩混合后靜置 30 min。加入2mL水,渦旋振蕩30s,再加入5mL乙腈渦旋混合。混合液超聲提取15 min,4 ℃下 10000 r/min 離心 10min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮氣緩緩吹至約2mL,加入8 mLPBS混勻,待凈化。

2.2.2 蛋、乳及液態(tài)乳制品

稱取1g試樣(精確至 0.01g),置于50 mL,聚丙烯離心管中,加入50 μL同位素內標混合使用液,振蕩混合后靜置 30 min。加入5 mL乙腈,渦旋混合后超聲提取 15 min,4 ℃下 10 000 r/min 離心10 min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮氣緩緩吹至約2mL,加入8 mLPBS混勻,待凈化。

2.2.3 谷物及嬰幼兒谷類輔助食品

稱取1g試樣(精確至 0.01g),置于50 mL聚丙烯離心管中,加入50 μL 同位素內標混合使用液,振蕩混合后靜置 30 min。加入10mL甲醇-水溶液(80+20),渦旋振蕩 30s,超聲提取 15min,4 ℃下10000 r/min 離心 10 min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氨氣緩緩吹至約2mL,加入8 mLPBS混勻,待凈化。

2.2.4  蔬菜、水果

稱取1g試樣(精確至 0.01 g),置于50 mL,聚丙烯離心管中,加入100 μL 鹽酸溶(10+90)混勻，再加入50 μL,同位素內標混合使用液,振蕩混合后靜置 30min。加入5mL乙腈,渦旋振蕩 30s,超聲提取15min,4 ℃下 10000 r/min 離心10min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮氣緩緩吹至約2mL,加入8 mLPBS混勻,待凈化。

2.2.5飲料

稱取1g試樣(精確至 0.01 g),置于2mL,聚丙烯離心管中,加入50 μL同位素內標混合使用液,振蕩混合后靜置 30min。10000 r/min 離心10min。取上清液至50 mL聚丙烯離心管中,加入10mLPBS 混勻,待凈化。

注:澄清試樣(如純凈水、礦泉水等)可不離心,直接加人PBS混勻。

3.凈化

將低溫下保存的雙酚A/F/S復合免疫親和柱（PN:AN70A036),恢復至室溫,然后讓柱內原有液體自然流盡。取1.2中試樣提取液全部過柱,自然流干,棄去全部流出液,再用10mL,水淋洗免疫親和柱。待水滴完后,用真空泵抽干免疫親和柱。加入1mL甲醇洗脫,收集洗脫液于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮氣緩緩吹干。準確加入0.40mL,甲醇,渦旋混合10s,再準確加入0.60mL水,渦旋混合后轉移至2mL聚丙烯離心管中,10000 r/min下離心5min,取上清液供液相色譜-串聯質譜儀測定。

4.儀器條件

4.1液相色譜條件

（1）色譜柱:Leosil XP雜化硅膠UPLC C18柱,100 mmx2.1 mm,1.7 μm（PN:AN80A006 ）或相當者

（2）流動相:A相為水,B相為甲醇。流動相梯度條件見表1。

（3）流速:0.3 mL/min。

（4）柱溫:40 ℃。

（5）進樣量:5 μL。

表1 流動相梯度條件

4.2 質譜條件

（1）電離方式:電噴霧電離,負離子模式。

（2）掃描方式:多反應監(jiān)測(MRM)。

（3）毛細管電壓:2.0 kV。

（4）離子源溫度:150 ℃。

（5）脫溶劑氣溫度:450 ℃。

（6）脫溶劑氣流量:900 L/h。

表2  定性離子對、定量離子對以及錐孔電壓和碰撞能量

準確吸取雙酚 A、雙酚F 和雙酚S的標準中間液各 625 μL,置于同一25mL容量瓶中,用 PBS 定容至刻度,充分混勻后用于免疫親和柱上樣。分別取同一批次3根免疫親和柱,每根柱的上樣量為8 mL。按凈化步驟進行上樣,淋洗和洗脫,收集洗脫液,用初始流動相稀釋定容至 10mL,上液相色譜-串聯質譜儀測定。用 20.0 μg/L,的溶劑標準工作溶液做單點校準計算上機試樣中雙酚 A、雙酚F 和雙酚S的含量。

結果判定:上機試樣中雙酚 A、雙酚F和雙酚S的含量均>18.0μg/L（即回收≥90%）可使用商品。