摘要：本研究主要采用了上海伏米科技流動之星I連續(xù)流動分析儀，采用連續(xù)流動法測定白酒中氰化物，對國家標準方法《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）來進行方法驗證，本實驗測定目標有標準曲線、空白樣品、實際市售白酒樣品以及加標回收率等，結(jié)果表明: 標準曲線、方法檢出限及定量限、精密度及加標回收等指標均滿足方法要求，表明合理使用連續(xù)流動分析儀來測定白酒中的氰化物含量時，操作難度較低且能滿足實際檢測的多樣性、微量性，并得到準確結(jié)果。

關(guān)鍵詞：連續(xù)流動分析儀；氰化物；白酒；方法驗證

Abstract: In this study mainly used the Shanghai Fumi Technology Flow Star I continuous flow analyzer to measure cyanide in Baijiu and conducted method verification on the national standard method "National Food Safety Standard Determination of Cyanide in Foods" (GB 5009.36-2023).

Abstract: In this study mainly used the Shanghai Fumi Technology Flow Star I continuous flow analyzer to measure cyanide in Baijiu and conducted method verification on the national standard method "National Food Safety Standard Determination of Cyanide in Foods" (GB 5009.36-2023). and the standard curve，standard substance，blank sample，actual sample and standard addition were measured. The results show that: standard curve，detection limit，accuracy，precision and other indicators meet the requirements of the method. It shows that when the continuous flow analyzer is used rationally to measure the cyanide content in Baijiu, the operation difficulty is low, and it can meet the diversity and traceness of actual detection and obtain accurate results.

Key words: continuous flow analysis; cyanide; Baijiu; verification of the method

1 引言

       氰化物（Cyanide）是特指含有氰基（-CN）或者氰離子（CN-）屬于高毒類的化合物，急性氰化物中毒時氰化物會受到胃酸的作用影響，水解生成氰氫酸而被吸收進入血液。在細胞色素C氧化酶中的三價鐵（Fe3+）與血液中的氰根產(chǎn)生結(jié)合，從而形生成氰化高鐵細胞色素氧化酶，這導(dǎo)致Fe3+失去傳輸電子的功能，進而導(dǎo)致了呼吸鏈的中斷，阻止細胞呼吸而死亡^[1]。由于白酒中的主要原料是以木薯和野生植物為主所釀制的，在發(fā)酵過程中會水解而產(chǎn)生氫氰酸，因此，這種酒的氰化物含量相對較高。然而，由谷物原料所釀制成的酒中氰化物含量則非常微量。盡管大部分產(chǎn)生的氫氰酸在原料的蒸煮過程中可以通過排氣揮發(fā)掉，但仍有少部分的氫氰酸殘留在白酒中^[2]。此外，農(nóng)藥的使用一部份污染了原料，以及釀酒過程中的變異反應(yīng)都是可能導(dǎo)致氰化物污染的原因^[3]。

     《食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒》（GB 2757-2012）^[4]中規(guī)定了氰化物限量應(yīng)小于8.0 mg/L（以HCN計，按100 %vol酒精度折算）。目前，白酒中氰化物的主要檢測方法有分光光度法、滴定分析法、電化學(xué)檢測法、氣相色譜法以及連續(xù)流動分析法等。相對于其他檢測方法耗時長、誤差大、檢測結(jié)果不穩(wěn)定等問題，連續(xù)流動分析法實現(xiàn)了氰化物的自動化檢測，能夠避免手動操作的不穩(wěn)定因素，同時也能夠節(jié)省大量的時間，提升精度，并且減少對于白酒基質(zhì)的影響。因此，本文根據(jù)目前Z新的白酒中的氰化物檢測標準《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）^[5] 進行方法驗證，以證明其準確性、精密度等等滿足白酒中氰化物的檢測，以利大批量的樣品分析檢測工作。

2  原理

2.1 方法原理

       由于白酒試樣中氰化物的堿解反應(yīng)發(fā)生在酸性環(huán)境（PH=3.8），因此，通過125℃在線蒸餾可將氰化物水解成氫氰酸的形式蒸餾出。此時氣態(tài)的氫氰酸會被氫氧化鈉溶液吸收，然后，在弱酸性的環(huán)境下，氰離子和氯氨Ｔ發(fā)生反應(yīng)，生成氯化氰，接著與異煙酸（Isonicotinic acid）進行反應(yīng)，Z后經(jīng)過水解生成戊烯二醛（Pentenedialdehyde），戊烯二醛與兩個1,3-二甲基巴比妥酸（1,3-Dimethylbarbituric acid）分子縮生合反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物（反應(yīng)機理如圖1所示），在波長為600 nm處對該紅色落合物有Z大吸收，之后進入比色池定量測定（白酒中氰化物的方法分析工作流程見圖2），與標準系列比較定量。方法的線性范圍為0.002~1000 mg/L CN-，檢出限為0.015 mg/L CN-，對于濃度高于上述測定上限的檢測樣品，可以適當?shù)倪M行稀釋后再測定，樣品分析頻率為22樣1 h。

圖1異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定白酒試樣中氰化物反應(yīng)肌理

圖2 連續(xù)流動-異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定白酒試樣中氰化物流程

2.2 儀器原理

       由上海伏米科技有限公司生產(chǎn)的流動之星I連續(xù)流動分析儀運用了并流技術(shù)，通過蠕動泵來擠壓彈性聚乙烯（PE）泵管，將一定比例的樣品試樣、試劑以及空氣注入封閉的管路反應(yīng)系統(tǒng)中，從而確保了空氣氣泡的間隔分布均勻與穩(wěn)定，使實驗結(jié)果能夠有效重現(xiàn)且精準?？諝鈿馀莘指罴夹g(shù)使得各個片段都能夠保持完好，降低了擴散和樣品帶過，同時能夠使管路內(nèi)的表面得到清潔的作用，此外，氣泡的分布情況也可以準確地揭示出全部系統(tǒng)問題的根源[7]。

       管路流動的過程中試樣與試劑能夠被平穩(wěn)地混合，產(chǎn)生化學(xué)作用。實現(xiàn)均勻混合并發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在化學(xué)分析模塊中，基本上都將會配置一個或以上的在線處理裝置，從而更加方便地實現(xiàn)在線蒸餾、萃取以及加熱等的各種處理，而后生成待檢測的物質(zhì)，流入檢測模塊（比色池）進行比色檢測，儀器記錄每一時段不同的信號變化，由軟件自動計算濃度值。和手工操作相比，樣品在線處理使得分析過程的效率得到了有效提高，同時還使得分析的可靠性得到加強，有助于人力、物力的節(jié)約，減少樣品和試劑的消耗量還有實驗廢液的產(chǎn)量，可為大量樣品提供快速、準確的分析大量樣本中的少量化學(xué)物質(zhì)。

        流動之星I連續(xù)流動分析儀在對樣品進行測定的過程中，能夠選擇通過單一化學(xué)反應(yīng)模塊來針對一個參數(shù)實施測定，或并聯(lián)兩個或多個化學(xué)反應(yīng)模塊， 針對這些模塊實施同時的測定，從而實現(xiàn)更高的分析效率，提高測試的速度。

3  實驗部分

3.1 儀器與試劑

3.1.1 主要試劑、材料與儀器

       實驗過程中用的試劑見表1，實驗裝置明細見表2。

表1 試劑與材料

表2 實驗裝置明細表

3.1.2 試劑配制

       本方法所用試劑均為分析純及以上，使用的水為經(jīng) Aquaplore 2S超純水機處理的超純水。

3.1.2.1 異煙酸/巴比妥酸顯色劑（R1）

       稱取4.4g氫氧化鈉溶于400mL水，待其完全溶解，稱取6.8g 1,3-二甲基巴比妥酸加入其中，待超聲溶解完全后稱取6.8g異煙酸攪拌溶解。用0.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH值至5.5，稀釋至500mL。在30℃ 下劇烈地攪拌（如使用磁力攪拌器）1小時然后過濾，可在5℃下穩(wěn)定三個月。

3.1.2.2 氯胺-T溶液（R2）

       稱取1g氯胺-T溶于400mL超純水中，稀釋至500mL，放置于棕色玻璃瓶中待溶液混均穩(wěn)定一周。

3.1.2.3緩沖溶液（R3）

       稱取13.6g磷酸二氫鉀和0.34g磷酸氫二鉀超聲溶解于800mL超純水，用0.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至5.2，用超純水稀釋至1000mL，Z後加入3.0 mL 30%的Brij35溶液混均，放置于棕色玻璃瓶中在4℃ 下穩(wěn)定三個月。

3.1.2.4吸收試劑（0.1N氫氧化鈉）（R4）

       稱取4g氫氧化鈉超聲溶解于500mL超純水，稀釋至1000mL。

3.1.2.5 蒸餾試劑（R5）

       量取250mL磷酸加入500mL超純水中，加入50mL次磷酸混合均勻，用超純水稀釋至1000mL。

3.2 樣品前處理

       根據(jù)《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）第五法流動注射/連續(xù)流動-分光光度法中，對于蒸餾酒及其配置酒以及食用酒精的樣品前處理方法如下，準確吸取1.00 mL試樣（其中芝麻香型白酒、醬香型白酒、特香型白酒試樣吸取0.25 mL）于25 mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液（1 g/L）定容至刻度混勻，放置10 min后，樣品堿解后進樣測定。由于本實驗僅采用米香型、清香型、濃香型等三種香型，因此，皆是使用稀釋倍數(shù)為25的方法進行樣品前處理。

3.3 實驗

3.3.1 標準曲線的配制

        取水中氰化物標準溶液10.00mL于100mL容量瓶中，用0.01N NaOH溶液定容至標線，得到濃度為5.00mg/L的標準中間液；移取20.00mL標準中間液，同樣使用0.01N NaOH溶液定容至100mL容量瓶中，得到濃度為1.00mg/L的標準使用液；取一組100mL容量瓶，移取0.00mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL和10.00mL的標準使用液，分別加入容量瓶中，用0.01N NaOH溶液定容至標線，濃度分別為0.00 mg/L、0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L，待用。

3.3.2 儀器條件

        連續(xù)流動分析儀是由自動進樣器、高精度蠕動泵、化學(xué)反應(yīng)單元、比色計檢測單元、數(shù)據(jù)處理單元等組成，總氰化物測定的儀器條件如下表3所示。

表3 流動之星I連續(xù)流動分析儀白酒中氰化物測定儀器條件

3.3.3 測定步驟

      （1）將流動之星I連續(xù)流動分析儀的空氣管、廢液管、清洗管等連接到指定位置后，連接流動之星I以及進樣器與計算機之間的數(shù)據(jù)線。

      （2）打開進樣器、流動之星I檢測器開關(guān)，啟動計算機，在“資源管理器”中查看“端口”確定已成功連接，啟動軟件選擇對應(yīng)端口。

      （3）啟動冷卻循環(huán)槽，先開電源開關(guān)，再開制冷及蒸餾器加熱開關(guān)開始加熱；檢查管路連接是否正確，蓋上泵蓋，啟動泵并吸取試劑。

      （4）點擊“增加”按鍵增添樣品數(shù)量來，設(shè)置完成后再點擊“運行”鍵，Z后輸入文件名保存新建項目。

      （5）運行結(jié)束先關(guān)閉蒸餾器及加熱器溫度已進行降溫，再將所有試劑管路從試劑瓶中取出，將管壁擦干或用超純水沖洗干凈后放入超純水清洗10min。

      （6）清洗后關(guān)閉蠕動泵并開啟泵蓋釋放泵管壓力，關(guān)閉流動之星I、進樣器以及冷卻循環(huán)槽開關(guān)，實驗結(jié)束。

4 結(jié)果與討論

4.1  標準曲線及方法檢出限

4.1.1 標準曲線

       將水中氰化物標準溶液濃度作為橫坐標，峰高作為縱坐標，通過軟件計算得出標準曲線與相關(guān)系數(shù)，具體可見表4。通過實驗結(jié)果可知，根據(jù)《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）通過異煙酸-巴比妥酸連續(xù)流動法來針對白酒中氰化物進行測定，質(zhì)量濃度在0~0.100mg/L（50mm比色池）范圍內(nèi)表現(xiàn)出了較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r=0.9999。

表4 測定白酒中氰化物的標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)r

4.1.2 方法檢出限

       本方法檢出限實驗根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ168-2020）附錄A方法特性指標確定方法^[6]，按照標準中樣品分析的全部步驟，對濃度值或含量為估計方法檢出限3~5倍的樣品進行n（n≥7）次平行測定，計算n 次平行測定的標準偏差，按公式（1）計算方法檢出限。 

MDL = t_(n-1,0.99) × S   （1）

式中：MDL - 方法檢出限；

n - 樣品的平行測定次數(shù)；

t - 自由度為n-1，置信度為99%時的t分布值（單側(cè)）；

S - n次平行測定的標準偏差。

      根據(jù)標準本次實驗選擇測定8次濃度為0.001 mg/L的標準，當 n=8時 ，t_{(n-1，0.99)}=2.998^[6]。檢出限測定結(jié)果如表5所示，計算標準偏差為0.039251，計算得出Z低檢出限為0 .12μg/L，根據(jù)所驗證的標準方法規(guī)定，定量限為 4 倍的方法檢出限，得出定量限為0.47μg/L。低于《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）所要求的方法檢出限0.015mg/L（15μg/L），定量限 0.050mg/L（50μg/L）。

表5 測定總氰化物的檢出限測定結(jié)果

4.2 方法精密度測試

       本實驗分采用有證標準物質(zhì)配制低濃度 0.005mg/L（1μg/L）、中濃度0.020mg/L（20μg/L）、及高濃度0.100mg/L（100μg/L）共3個濃度梯度，其中，低濃度目的是測定下限附近濃度，中濃度是取校準曲線的中間點附近濃度而高濃度則是取校準曲線中線性范圍上限附近的濃度，此外，取5種酒樣做檢測，分別對各濃度及酒樣按照方法的分析步驟和儀器條件進行6次重復(fù)性實驗。此處白酒樣品根據(jù)《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）中，試樣中氰化物（以CN-計）含量需將原始實測值放大25倍，下表呈現(xiàn)為未放大的原始實測值。

表6 測定白酒樣品方法精密度（n=6）

       測定結(jié)果如表6所示，低、中、高3種濃度RSD（%） 結(jié)果在0.36%~3.10%范圍內(nèi)，5組不同濃度市售白酒樣品所測試的RSD（%）結(jié)果在0.36%~ 3.82%范圍內(nèi)，均符合方法要求。

4.3 加標回收試驗

      按《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）方法條件對市場上售賣的不同類型的白酒進行稀釋檢測分析，其中S1為米香型（酒精濃度為28%vol），S2為清香型（酒精濃度為35%vol），S3、S4、S5為濃香型（酒精濃度分別為42%vol、52%vol、70%vol），不同酒樣中檢測出少量本底值，試樣中氰化物（以CN-計）含量為原始實測值放大25倍。對檢出待測物不同類型白酒以及濃度做加標回收試驗，平行測定6次，加標量為0.005mg/L以及0.020mg/L，結(jié)果顯示，加標回收率在86.3%~109.4%范圍內(nèi)，此外，計算相對標準偏差（RSD）結(jié)果在0.44~2.45范圍內(nèi)，說明該方法具有可靠性和準確性，結(jié)果見表7。

表7 測定白酒樣品加標回收率、精密度

5 小結(jié)

5.1標準曲線評價

    本次實驗繪制的標準曲線相關(guān)系數(shù)r=0.9999，滿足所驗證方法《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）r≥0. 999 的要求。

5.2檢出限及定量限評價

     本次實驗計算出方法檢出限為0.12μg / L，定量限為0.47 μg/L，檢出限低于所驗證方法要求的方法檢出限0.015mg/L（15μg/L），定量限0.050mg/L（50μg/L）。

5.3方法精密度測試評價

     根據(jù)測定結(jié)果可知，低、中、高3種濃度相對標準偏差RSD（%）結(jié)果在0.36%~3.10%範圍內(nèi)，5組不同濃度市售白酒樣品所測試的RSD（%）結(jié)果在0.36%~ 3.82%範圍內(nèi)，均符合方法要求。

5.4加標回收試驗評價

     根據(jù)測定結(jié)果可知，加標量為0.005mg/L以及0.020mg/L時，不同類型白酒以及濃度的加標回收率分別在86.3%~97.4%以及88.8%~109.4%，測定結(jié)果滿足所驗證方法要求。

5.5結(jié)論

     本實驗使用上海伏米科技有限公司生產(chǎn)的流動之星I連續(xù)流動分析儀對國家標準方法《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》（GB 5009.36-2023）進行方法驗證，對所有的測試參數(shù)，如標準曲線、方法檢出限、準確度和精密度，都達到了方法的規(guī)定，從結(jié)果來看流動之星I連續(xù)流動分析儀的自動進樣、自動分析的過程能夠有效避免傳統(tǒng)方法實驗中人為誤差及安全性，測定過程簡單且試劑藥品用量少，能夠通過此方法來對大批量樣品進行測定，更能滿足實際檢測的多樣性、微量性，并得到準確結(jié)果。

參考文獻：

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