在前期的案例中，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)聯(lián)合激光顯微切割（Laser Microdissection, LMD)技術(shù)，成功實現(xiàn)了空間深度代謝組學和脂質(zhì)組學的分析^1，2。隨著蛋白質(zhì)組學質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，最新的空間蛋白質(zhì)組學可以在細胞和組織水平上的實現(xiàn)蛋白空間分布和相互作用研究，得到蛋白在細胞特異性表達等重要信息³。通過LMD技術(shù)將感興趣的組織微區(qū)或細胞樣品進行精確切割和收集，經(jīng)過微量樣品蛋白提取并酶解成肽段，進而使用高靈敏度質(zhì)譜進行檢測，以獲得不同空間位置和功能區(qū)域的蛋白表達圖譜。空間蛋白質(zhì)組學研究有助于分析疾病早期演化及特定病理環(huán)境下的空間-分子基礎(chǔ)，可以為疾病的致病機理研究和早期診斷治療提供重要線索。

與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)學前處理不同，基于LMD技術(shù)得到的樣品體積小，蛋白含量低，需要高靈敏度的檢測技術(shù)從而挖掘更加豐富的蛋白質(zhì)信息。

在本次實驗中，從小鼠心臟切片上，LMD實現(xiàn)了約0.2mm²大小的組織微區(qū)樣品的快速切割和收集。LMD具備下述技術(shù)優(yōu)勢：

第一、切割精準，真正實現(xiàn)“所見即所得”；

第二、靈活度高，切割目標區(qū)域按需隨意選取，激光能量可調(diào)以適用不同組織類型，同類樣本的可累積收集達到需要樣品量等；

第三、操作簡便快捷，LMD能夠在數(shù)秒中的時間內(nèi)完成圖1所示樣品的高效地切割和收集，保證結(jié)果真實性。

ZenoTOF 7600系統(tǒng)具有Zeno trap功能和全新的Zeno? SWATH DIA工作模式，可以有效提高肽段檢測靈敏度; 同時超快的采集速度（窗口數(shù)為85個）實現(xiàn)肽段二級的高效覆蓋。優(yōu)異的靈敏度和超快的采集速度，保證微量樣品中蛋白組的深度分析。本次實驗中從約0.2mm²大小的小鼠心臟組織樣品提取的蛋白，經(jīng)過ZenoTOF 7600的采集分析，每次都可以鑒定到超過5300多個蛋白。結(jié)果證明ZenoTOF 7600具備優(yōu)異的靈敏度和采集速度，適用于LMD切割收集的微量樣本中蛋白組的深度分析。

SWATH是開創(chuàng)的非標記定量蛋白組學的黃金技術(shù)，被廣泛應用于大隊列蛋白組樣品分析。Zeno? SWATH DIA是在 ZenoTOF 7600系統(tǒng)上開發(fā)的全新一代的非標記蛋白組分析技術(shù)，具備樣本通量高、蛋白覆蓋深、定量高精準等優(yōu)勢。本次實驗的結(jié)果顯示，Zeno? SWATH DIA技術(shù)檢測到的可定量蛋白（CV<20%）占總鑒定蛋白數(shù)量的比例超過92.5%，表明微量樣本的蛋白組分析的優(yōu)異重現(xiàn)性和結(jié)果的高可信度，滿足LMD采集的組織微區(qū)中蛋白表達譜的檢測要求。

小鼠心臟組織切片（10μm）經(jīng)過激光顯微切割(LMD)并收集約0.2mm²大小的區(qū)域（圖1）；經(jīng)過一些列的樣品前處理，從收集到的微區(qū)樣品中提取總蛋白并酶切成肽段；最終，樣品經(jīng)過 ZenoTOF^? 7600采集分析其中的蛋白組信息。

使用NanoLC系統(tǒng)， 流速為350 nL/min, 60 min整體洗脫梯度。 ZenoTOF 7600系統(tǒng)采用Zeno? SWATH DIA采集方式，一級掃描范圍400-1500，可變窗口數(shù)：85個，二級掃描范圍100-1500 。

Zeno? SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA-NN1.8.1軟件處理，使用library-free模式，數(shù)據(jù)庫采用UniProt下載mouse的fasta蛋白序列。

樣品用Zeno? SWATH DIA方法重復采集三針，從TIC圖上看（圖3），在納升液相系統(tǒng)下，肽段在60min梯度內(nèi)得到很好的分離，并且有很好的重復性和信號強度，表明儀器在數(shù)據(jù)采集過程中有很好的穩(wěn)定性，從而保證實驗結(jié)果的準確可靠。

圖3. Zeno? SWATH DIA采集樣品的總離子流圖（TIC）

統(tǒng)計樣品三針重復的結(jié)果，以小于1% Global FDR為標準，三針重復共計鑒定到5394個蛋白（圖4A），三針共有的蛋白鑒定數(shù)為5207。以三針重復定量結(jié)果CV<20%為標準，可定量蛋白數(shù)目有4991個，即超過92.5%的蛋白都能被準確地定量。從肽段precursors水平上來看，三針重復共計鑒定到48669個肽段（圖4B），CV<20%的數(shù)目為41521。Zeno? SWATH DIA的結(jié)果都具有很好的重復性和定量準確性，充分體現(xiàn)了這一技術(shù)面對LMD處理的微量樣品的優(yōu)勢。

將原始數(shù)據(jù)導入skyline軟件進行分析，無論對于信號高的肽段（如蛋白D3Z6P0的特征肽段TAEGIAEWLR，圖5A）,還是信號比較低的肽段（如蛋白E9PV24的特征肽段GLIDEANQDFTNR，圖5B），都可以提取到很好的XIC圖。表明ZenoTOF 7600系統(tǒng)的Zeno trap通過二級碎片離子進行富集，特別是對于低豐度肽段二級的富集，實現(xiàn)檢測的高靈敏度和高重現(xiàn)性，保證結(jié)果的真實和可靠性。