導(dǎo)讀

表皮屏障是通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞的干細(xì)胞的激活、增殖和分化而恢復(fù)的，但其在損傷和老化后通過(guò)不明確的機(jī)制阻礙了這一修復(fù)過(guò)程。作者在之前發(fā)現(xiàn)了老年小鼠表皮代謝功能障礙的基因特征，但表皮修復(fù)和年齡相關(guān)生長(zhǎng)缺陷的精確調(diào)控機(jī)制尚未建立。所以作者使用衰老小鼠模型以及代謝調(diào)節(jié)因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔激活物-1α（Pgc-1α）有條件表皮缺失的小鼠，探索控制損傷和應(yīng)激后皮膚修復(fù)的細(xì)胞途徑。

美國(guó)東北大學(xué)生物系與加拿大渥太華大學(xué)生物化學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)系聯(lián)合研究的研究人員在Molecular Metabolism雜志上發(fā)表了題為《Pgc-1α controls epidermal stem cell fate and skin repair by sustaining NAD homeostasis during aging》的文章。文中的H&E染色結(jié)果和免疫熒光結(jié)果均應(yīng)用Echo Revolve 顯微鏡進(jìn)行顯微成像。

研究亮點(diǎn)：

通過(guò)ECHO Revolve顯微鏡對(duì)染色的外植體和免疫熒光結(jié)果進(jìn)行成像，得到分辨率高，細(xì)節(jié)清晰的圖像，并結(jié)合其他結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)：

?   衰老延緩小鼠傷口再上皮化，與Pgc-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低相關(guān)。

?  表皮Pgc-1α的缺失減緩了愈合，并由于NAD穩(wěn)態(tài)的破壞而減少了增殖。

? 低水平的表皮NAD會(huì)增強(qiáng)p53生長(zhǎng)停滯，但在補(bǔ)充N(xiāo)AD后會(huì)逆轉(zhuǎn)。

? 衰老會(huì)破壞表皮NAD穩(wěn)態(tài)，但NAD前體可逆轉(zhuǎn)表皮生長(zhǎng)缺陷。

文中所有的H&E染色和免疫熒光結(jié)果均是使用Echo Revolve Generation 2顯微鏡進(jìn)行的快速清晰的成像。揭示了衰老會(huì)損傷傷口愈合過(guò)程中的表皮再生長(zhǎng)，并導(dǎo)致Pgc-1α的表達(dá)降低。表皮Pgc-1α有條件缺失的小鼠表現(xiàn)出更大的炎癥和UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞分化、減少的增殖和較慢的傷口愈合。epiPgc-1αKO小鼠還表現(xiàn)出角質(zhì)形成細(xì)胞NAD水平降低、端?？s短和多聚ADP核糖化增加，導(dǎo)致應(yīng)激刺激的p53和p21信號(hào)增強(qiáng)。當(dāng)NAD因Pgc-1α缺失或NAD合成的藥理學(xué)抑制而減少時(shí)，應(yīng)激誘導(dǎo)的增殖減少，分化增加，并通過(guò)表皮脫落增強(qiáng)保護(hù)DNA免受損傷。同樣，老年小鼠表現(xiàn)出表皮NAD穩(wěn)態(tài)紊亂和p53活化增強(qiáng)，導(dǎo)致?lián)p傷后p21生長(zhǎng)停滯。NAD前體治療可恢復(fù)老年皮膚到年輕皮膚的表皮生長(zhǎng)狀態(tài)。

研究成果：

▼圖1證明了與年齡相關(guān)的傷口愈合和表皮生長(zhǎng)障礙與Pgc-1α信號(hào)傳導(dǎo)減少有關(guān)。

▲ 圖1.衰老導(dǎo)致傷口愈合較慢，表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)受損，與Pgc-1α信號(hào)傳導(dǎo)減少相關(guān)。（A）損傷后9天內(nèi)的傷口閉合（右側(cè)第9天圖像）和（B）年輕（4月齡）和老年（24月齡）C57 / Bl6小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)。使用結(jié)晶紫對(duì)（B）中的細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行染色以便于觀(guān)察。（C）表皮層分層及其標(biāo)志物的圖解。（D）傷口損傷后5天，年輕和老年皮膚中角質(zhì)蛋白-14陽(yáng)性表皮舌的平均長(zhǎng)度。（E）損傷后5天，年輕和老年小鼠愈合傷口基礎(chǔ)表皮前緣右側(cè)的EdU細(xì)胞。（F）年輕和老年小鼠傷口表皮的代表性圖像。（G）年輕和老年小鼠表皮中Pgc-1α和Pgc-1β mRNA的qPCR數(shù)據(jù)。（H）與對(duì)照相比，急性UVB暴露后24和48小時(shí)，年輕小鼠的表皮Pgc-1α mRNA的表達(dá)量。

▼圖2證明了表皮Pgc-1α的缺失可減少應(yīng)激誘導(dǎo)的增殖，增強(qiáng)分化并導(dǎo)致傷口愈合緩慢。

▲ 圖2.表皮Pgc-1α的遺傳缺失在生理性皮膚損傷后減少細(xì)胞生長(zhǎng)并增強(qiáng)分化。（A）角質(zhì)形成細(xì)胞中cre-lox重組以刪除Pgc-1α的示意圖。（B）7–9 WT和epiPgc-1αKO小鼠的表皮Pgc-1β mRNA（Ppargc1a）。（C）角蛋白14（K14）、角蛋白10（K10）和loricrin（Lor）的代表性圖像。（D）UVB誘導(dǎo)WT和epiPgc-1αKO小鼠中EdU表皮細(xì)胞和（E）K10層厚度相對(duì)于對(duì)照皮膚的折疊變化。（F）UVB暴露表皮中γH2AX和胸腺嘧啶二聚體的定量，右側(cè)為5 WT和epiPgc-1αKO小鼠的代表性圖像。（G）TPA誘導(dǎo)WT和epiPgc-1αKO小鼠EdU表皮細(xì)胞和（H）K10層增厚相對(duì)于對(duì)照皮膚的折疊變化。（I）7–8 WT和epiPgc-1αKO小鼠9天后的開(kāi)放傷口面積。

▼圖3表明Pgc-1α維持表皮NAD穩(wěn)態(tài)，NAD挽救的藥理學(xué)抑制促進(jìn)UVB誘導(dǎo)的分化并防止DNA損傷。

▲ 圖3.Pgc-1α缺失的角質(zhì)形成細(xì)胞破壞了NAD代謝，對(duì)NAD合成的藥物抑制足以減少增殖并增強(qiáng)UVB誘導(dǎo)的分化。（A）7–9 WT和epiPgc-1α KO小鼠表皮NAD代謝相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)。（B）4–5只WT和epiPgc-1α KO小鼠尾部表皮中NAD的相對(duì)水平。（C）72小時(shí)后，來(lái)自年輕皮膚外植體的體外角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)Nampt抑制劑FK866的劑量反應(yīng)。（D）C57 / Bl6小鼠中FK866應(yīng)用與UVB應(yīng)激相結(jié)合的示意圖。（E） 對(duì)照手術(shù)或UVB暴露48小時(shí)后，用局部FK866（100 nM）或載體（Veh；乙醇）處理的每組5–6只小鼠的表皮NAD水平。（F）角蛋白10層級(jí)增厚。（G）表皮增殖（EdU）的變化，以及（H）γH2AX陽(yáng)性表皮細(xì)胞的豐度。代表性免疫熒光圖像（F–H）顯示在量化右側(cè)。

▼圖4證明了增加Pgc-1a缺失小鼠的NAD水平挽救異常應(yīng)激誘導(dǎo)的分化并恢復(fù)傷口愈合。

▲ 圖4.用NAD前體治療表皮Pgc-1αKO小鼠可加速皮膚愈合并抑制UVB誘導(dǎo)的分化。（A–B）使用4 WT和epiPgc-1αKO皮膚樣品（NAD前體煙酰胺單核苷酸（NMN）、煙酰胺（NAM）或煙酰胺核苷（NR）處理或未處理），角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)為外植體面積的一部分或載體條件的數(shù)倍。（C）（A–B）生長(zhǎng)出的代表性圖像用結(jié)晶紫染色，以便于可視化。（D–F）每天注射賦形劑或500 mg/kg NR的4-7 WT和epiPgc-1αKO小鼠的肝臟NAD、尾表皮NAD水平和傷口完全閉合的時(shí)間。損傷后第0天（D0）、第11天（D11）和第13天（D13）的代表性圖像。（G） UVB暴露和NR劑量示意圖。（H–K）用載體或煙酰胺核苷（NR）處理的4只WT和Pgc-1αKO小鼠的UVB暴露表皮中的角蛋白10增厚、γH2AX細(xì)胞和胸腺嘧啶二聚體細(xì)胞。代表性免疫熒光圖像及量化結(jié)果。

▼圖5證實(shí)了Pgc-1α的缺失誘導(dǎo)端?？s短，增強(qiáng)Parp活性并增強(qiáng)應(yīng)激誘導(dǎo)的p53信號(hào)傳導(dǎo)。

▲ 圖5.表皮Pgc-1α缺失后的端粒功能障礙以NAD依賴(lài)的方式使干細(xì)胞對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的p53活化和核增大敏感。（A）定量6–7 WT和epiPgc-1αKO小鼠表皮裂解物中多聚和單ADP核糖（MAR/PAR）的免疫印跡。（B）4–6 WT和epiPgc-1αKO小鼠的亮染MAR/PAR表皮細(xì)胞數(shù)量（MAR/PAR+高）。（C）表皮裂解液中泛乙酰賴(lài)氨酸的免疫印跡定量。（D）平均表皮端粒長(zhǎng)度。（E）5–6 WT和epiPgc-1αKO小鼠的載體和TPA處理皮膚中的核HMGB1細(xì)胞和（F）基底層核大小。（G）用載體或煙酰胺核苷（NR，500 mg/kg）處理的WT和epiPgc-1αKO小鼠58小時(shí)后，UVB暴露表皮的核HMGB1或（H）p21表皮細(xì)胞以及（I）基底層核大小。（J）用局部載體或FK866處理的6只C57Bl/6小鼠中，對(duì)照手術(shù)和UVB暴露表皮的核HMGB1或（K）p21表皮細(xì)胞以及（L）基底層核大小。代表性免疫印跡（A、C）或免疫熒光圖像（B、E、G、H、K）顯示在量化右側(cè)。

▼圖6老年表皮表現(xiàn)出NAD穩(wěn)態(tài)紊亂和p21生長(zhǎng)停滯增加。

▲ 圖6.衰老破壞表皮NAD穩(wěn)態(tài)并增強(qiáng)p53-p21信號(hào)軸。（A）年輕小鼠與老年小鼠表皮NAD的相對(duì)水平和NAD代謝相關(guān)基因的（B）mRNA表達(dá)。年輕和老年表皮中（C）MAR/PAR?；拿庖哂≯E。（D）賴(lài)氨酸乙?；停‥）乙?；鵳53（K382）的免疫印跡，右側(cè)為定量。（F）年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠損傷后5天，前緣內(nèi)的表皮p21細(xì)胞。右側(cè)的代表性圖像，虛線(xiàn)顯示了從箭頭開(kāi)始的前緣的前1000μm。（G）用所示NAD前體處理72小時(shí)的年輕和老年小鼠的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞外植體生長(zhǎng)。

通過(guò)ECHO Revolve正倒置一體顯微鏡的優(yōu)質(zhì)成像，得到了所需的高清圖片，不僅用于觀(guān)察分析，還可使用tiff黑白原圖進(jìn)行定量分析，Z終得到整個(gè)結(jié)論。該項(xiàng)研究確定了表皮Pgc-1α通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞NAD+和對(duì)p53驅(qū)動(dòng)的生長(zhǎng)停滯的下游影響，在控制表皮修復(fù)中的新作用。另外還發(fā)現(xiàn)，衰老表皮中存在明顯的平行機(jī)制，表明NAD信號(hào)傳導(dǎo)是生理性皮膚修復(fù)的重要控制因素，并且該途徑的功能障礙導(dǎo)致了與年齡相關(guān)的傷口修復(fù)缺陷。

期刊介紹：

《Molecular Metabolism》致力于作為一個(gè)報(bào)告能量穩(wěn)態(tài)以及代謝紊亂（如肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥）的病因、發(fā)展、治療和相關(guān)健康后果方面的突破性發(fā)現(xiàn)的平臺(tái)。該雜志發(fā)表了以Z高標(biāo)準(zhǔn)生成的假說(shuō)驅(qū)動(dòng)的研究，為對(duì)能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)行為、生理學(xué)和功能障礙等機(jī)制的理解鋪平了道路。Z新影響因子8.568。

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