引言

光學(xué)顯微鏡是拍攝生物組織或者細(xì)胞圖像的主要手段。傳統(tǒng)顯微鏡通常采用白光照射樣品，基于測量吸收、散射和折射率的變化實(shí)現(xiàn)光學(xué)成像，但缺乏對細(xì)胞內(nèi)特定化學(xué)物質(zhì)的分辨能力。熒光顯微鏡采用單色連續(xù)光照射樣品，通過將熒光分子與生物體內(nèi)的特定蛋白結(jié)合來區(qū)分化學(xué)物質(zhì)，但是，熒光探針受限于光毒性、光漂白等。

非線性光學(xué)顯微成像采用超短脈沖激光照射樣品，基于強(qiáng)場激光的非線性效應(yīng)獲取高特異性、高空間分辨的圖像，包括無需標(biāo)記的相干反斯托克斯拉曼散射成像（CARS）、受激拉曼散射成像（SRS）、二次諧波（SHG）、三次諧波成像（THG），以及采用熒光蛋白標(biāo)記的雙光子成像（2PM）和三光子成像（3PM）。

非線性光學(xué)顯微成像的不斷發(fā)展對超短脈沖激光光源提出了許多新需求，如相干拉曼散射成像需要時間同步、空間重合、波長差匹配拉曼振轉(zhuǎn)能級的雙波長超短脈沖激光。進(jìn)一步，為實(shí)現(xiàn)高速率、高光譜的相干拉曼成像，還需要激光波長調(diào)諧速度更快、光譜覆蓋范圍更寬。

雙光子成像常采用中心波長920 nm或1030 nm的飛秒激光，脈沖寬度一般要求在百飛秒附近，幾十飛秒更佳。此前，通常采用的是鈦寶石飛秒激光器或者固體激光泵浦光參量振蕩器，但這類光源體積較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要安裝于恒溫恒濕的超凈環(huán)境，也需要專業(yè)人員提供定期維護(hù)。光纖超短脈沖激光器體積小、重量輕、穩(wěn)定性強(qiáng)、光束質(zhì)量好、脈沖能量適中，已成為非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)邁向?qū)嶋H應(yīng)用的重要推手，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

超短脈沖光纖激光器在生物成像中潛力無限

1.光纖參量振蕩器應(yīng)用于窄帶CARS系統(tǒng)

窄帶CARS成像是針對某個特定的拉曼頻率，采用兩束窄帶光譜皮秒脈沖激發(fā)的相干拉曼散射成像，可用于對脂滴進(jìn)行成像進(jìn)而研究細(xì)胞代謝和癌癥病狀。傳統(tǒng)固體光源一般為兩路輸出的空間激光，需要采用時間延遲和空間重合的光路硬件，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、體積稍大。朗研光電的技術(shù)團(tuán)隊開發(fā)了基于光纖結(jié)構(gòu)的參量振蕩器，泵浦光經(jīng)過光子晶體光纖產(chǎn)生四波混頻效應(yīng)。如此，泵浦光和信號光可從同一光子晶體光纖輸出，具有時間自同步、空間自重合的特點(diǎn)，可直接應(yīng)用于窄帶CARS成像，極大減小了光源的體積和系統(tǒng)復(fù)雜度。

為了探測不同的振轉(zhuǎn)能級，需要激光波長可調(diào)諧；為了實(shí)現(xiàn)對不同密度生物樣品的無損傷激發(fā)，需要脈沖重頻可控制；為了分辨相鄰的拉曼譜線，需要激光光譜寬度更窄。為此，朗研光電的技術(shù)團(tuán)隊提出了基于偏振操控的色散濾波、有理數(shù)諧振、腔內(nèi)放大新方案，實(shí)現(xiàn)了波長連續(xù)可調(diào)諧、重頻比例可控制、光譜寬度可二次壓縮的雙波長超快激光輸出。通過長光纖提供的時間延遲和色散濾波，實(shí)現(xiàn)了970-1025 nm的可調(diào)諧信號光輸出；提出了基于偏振調(diào)諧的波段選擇方案，產(chǎn)生了780-791 nm和960-1000 nm帶間可切換、帶內(nèi)可調(diào)諧的脈沖輸出；基于有理數(shù)諧振的參量振蕩器，在不改變腔長的情況下，實(shí)現(xiàn)重復(fù)頻率在0.5-6.0 MHz范圍內(nèi)的靈活控制；采用在參量振蕩器中內(nèi)置光放大器的有源反饋腔結(jié)構(gòu)，在提升信號光功率的同時，有效抑 制了光譜展寬[1]。圖1為朗研光電和深圳大學(xué)共同研制的CARS光譜成像儀。

圖1 光纖超短脈沖激光光源應(yīng)用于CARS光譜成像儀

2.飛秒光纖同步光源應(yīng)用于術(shù)中無標(biāo)記病理成像

基于受激拉曼散射的無標(biāo)記病理成像，在癌細(xì)胞檢測、術(shù)中高精度切緣分析方面潛力巨大。受激拉曼散射成像對光源的相對強(qiáng)度噪聲要求極高，前述光纖參量振蕩器的噪聲水平一般難以達(dá)到。采用主動或被動光學(xué)同步的兩臺超短脈沖激光器，能有效避免非線性效應(yīng)引起的相對強(qiáng)度噪聲。同時，從能量轉(zhuǎn)換效率的角度來看，相比于光子晶體光纖頻率變換技術(shù)，激光器直接輸出的平均功率更高。在光學(xué)同步技術(shù)方案中，主動同步方案所采用的電子反饋方式稍顯復(fù)雜，而基于非保偏光纖的被動光學(xué)同步方案腔長失配距離較短，穩(wěn)定性易受環(huán)境干擾。

針對這一難題，我們提出并驗(yàn)證了一種基于全保偏光纖的主-從注入全光被動同步方案。該方案采用摻鉺和摻鐿鎖模光纖振蕩器，結(jié)合光學(xué)倍頻和非線性展寬產(chǎn)生波長可調(diào)諧的雙色皮秒脈沖，已應(yīng)用于受激拉曼散射成像及中紅外上轉(zhuǎn)換探測等研究領(lǐng)域。

其中，光譜展寬模塊的設(shè)計對于光源的調(diào)諧性能和噪聲表現(xiàn)至關(guān)重要。由于光子晶體光纖的空間耦合光路結(jié)構(gòu)復(fù)雜、全光纖熔接一致性差，為實(shí)現(xiàn)寬調(diào)諧、低噪聲的光譜展寬，我們設(shè)計并驗(yàn)證了基于單模光纖或增益光纖的全光纖展寬結(jié)構(gòu)。采用長度為百米量級的單模光纖，實(shí)現(xiàn)了1018-1051 nm的光譜展寬；通過色散管理的摻鐿光纖放大器，僅采用增益光纖，產(chǎn)生了1012-1068 nm的寬帶拋物線脈沖。

2024年，通過管理摻鐿光纖放大器的非線性光譜演化過程，研制成功針對水分子、蛋白和脂類分子的同步飛秒激光，輸出雙波長的典型參數(shù)為785 nm/120 fs/200 mW和1025 nm/250 fs/1 W。近期，該同步光源已安裝于醫(yī)用手推車上，用于開展受激拉曼散射成像和術(shù)中無標(biāo)記病理檢測。

圖2 鼠耳樣品多模態(tài)成像[2]。（a）2930 cm-1，（b）2850 cm-1，（c）雙波段組合圖；（d）CARS，（e）二次諧波，（f）雙模態(tài)組合圖

3.多波長光纖超短脈沖光源應(yīng)用于小鼠腎切片雙光子成像

雙光子顯微鏡相比傳統(tǒng)單光子熒光顯微鏡，具有空間分辨率高、穿透距離深、細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)，在生物成像中發(fā)揮著重要的作用。隨著綠色熒光團(tuán)和熒光蛋白的廣泛使用，920 nm波段的飛秒激光成為主要光源。摻鐿光纖激光器輸出功率高、脈沖寬度窄，技術(shù)和器件發(fā)展相對成熟。通過光子晶體光纖進(jìn)行非線性光譜展寬，利用濾光片選擇所需波長，可獲得寬帶可調(diào)諧的飛秒激光。

基于上述方案，朗研光電的技術(shù)團(tuán)隊實(shí)現(xiàn)了926 nm激光脈沖輸出，脈沖寬度88 fs，脈沖能量4.0 nJ，重復(fù)頻率78 MHz。中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所采用該光源實(shí)現(xiàn)了小鼠腎切片的雙光子熒光圖像（見圖3）。此外，摻鐿光纖激光器輸出的1030 nm波長可用于激發(fā)紅色熒光蛋白，結(jié)合頻率變換和濾波系統(tǒng)后，有望通過一臺飛秒激光器實(shí)現(xiàn)多色雙光子成像。

圖3 雙光子系統(tǒng)成像裝置圖（a）及小鼠腎切片成像結(jié)果（b）[3]

4.綠色皮秒光纖激光應(yīng)用于無標(biāo)記生物物理快速成像

定量相位顯微成像是一種無標(biāo)記、非侵入的顯微成像技術(shù)。相較于相干拉曼散射測量分子振轉(zhuǎn)能級的方法，定量相位成像是一種生物物理成像方案。它通過激發(fā)光與細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生相位變化，提取出細(xì)胞大小、形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)等信息。傳統(tǒng)定量相位顯微成像的速度在kHz量級，主要受限于光學(xué)相機(jī)。采用超短脈沖激光結(jié)合高速光電探測可極大提升定量相位顯微成像的速度。

香港大學(xué)Kevin K.M.Tsia課題組通過采用自由空間角度啁啾延時裝置，將重復(fù)頻率10 MHz、平均功率1 W、脈沖寬度15 ps的超短脈沖分散成近百個空間分布、時間延遲的掃描光點(diǎn)，與微流控系統(tǒng)結(jié)合后，實(shí)現(xiàn)了MHz量級線掃描速度、每秒1萬個細(xì)胞左右的吞吐量。這種基于空間啁啾的分光方案對激光光束質(zhì)量提出了極高要求，光斑需滿足傳輸數(shù)十米之后依然維持較好的形狀，圖四是他們采用高速定量相位成像系統(tǒng)測量的細(xì)胞生物物理圖像與熒光標(biāo)記成像圖像對比。

圖4 采用高速定量相位成像系統(tǒng)測量的細(xì)胞生物物理圖像與熒光標(biāo)記成像圖像對比[4]

結(jié)束語

光學(xué)顯微鏡打開了微觀世界的大門，讓細(xì)胞清晰的展現(xiàn)在人類眼前。超短脈沖激光與光學(xué)顯微鏡的結(jié)合，催生出相干拉曼、多光子等新穎的非線性光學(xué)成像技術(shù)，目前正朝著小型化、多模態(tài)、高速度、內(nèi)窺鏡等方向發(fā)展，將推動光學(xué)成像用于臨床檢測與術(shù)中輔診中。

作者簡介：

楊康文，上海理工大學(xué)副教授，博士生導(dǎo)師，上海理工大學(xué)志遠(yuǎn)學(xué)者，香港大學(xué)訪問助理教授，香港先進(jìn)生物醫(yī)學(xué)儀器中心博士后研究員。2014年博士畢業(yè)于華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國家重 點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，研究方向?yàn)槌旃饫w激光在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的應(yīng)用。

郝強(qiáng)，上海理工大學(xué)副教授，廣東朗研科技有限公司總經(jīng)理。主要從事超快激光技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用推廣工作，參與了科技部國家重大儀器專項、國家重 點(diǎn)研發(fā)計劃等項目，發(fā)展了多波段超短脈沖高可靠鎖模和低噪聲放大技術(shù)，研發(fā)了系列超快激光光源并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等。

參考文獻(xiàn)：

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2. K. Yang, Y. Shen, J. Ao, et al.Passively synchronized mode-locked fiber lasers for coherent anti-Stokes Raman imaging[J]. Opt. Express, 2020, 28：13721-13730.

3. P. Wang, X. Xu, Z. Guo, et al.926 nm Yb-doped fiber femtosecond laser system for two-photon microscopy[J]. Appl. Phys. Express, 2019, 12:32008.

4. G. Yip, M. Lo, W. Yan,et al.Multimodal FACED imaging for large-scale single-cell morphological profiling[J]. APL Photonics, 2021, 6:70801.