RNA結(jié)合蛋白(RBP)可通過細(xì)胞內(nèi)的無膜細(xì)胞器(MLO)調(diào)控基因表達(dá)。Rim4是釀酒酵母細(xì)胞中的一種RBP，能夠形成減數(shù)分裂所需的淀粉樣蛋白聚集。當(dāng)出現(xiàn)溫度升高等環(huán)境變化導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，Rim4濃縮形成可逆的應(yīng)激顆粒(圖1C)。

圖1 A：Rim4蛋白結(jié)構(gòu)域和減數(shù)分裂示意圖；B：AlphaFold預(yù)測的Rim4的三維結(jié)構(gòu)；C：減數(shù)分裂前期I的細(xì)胞中GFP-Rim4在不同的條件應(yīng)激下形成foci。

近期，發(fā)表于bioRxiv的一篇文章利用超精準(zhǔn)可調(diào)節(jié)溫度控制模塊-VAHEAT（點(diǎn)擊即可咨詢設(shè)備）對活細(xì)胞內(nèi)溫度誘導(dǎo)相變進(jìn)行了深入研究^[1]。

研究人員將酵母細(xì)胞懸液滴加在VAHEAT的智能基板上并放置于顯微鏡適配器中，連接上VAHEAT控制器，即可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞樣品的溫度控制。VAHEAT可在0.1s左右使樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)所需的溫度并穩(wěn)定控溫。當(dāng)加熱至一定的溫度，且經(jīng)過一定時(shí)間后，Rim4即可濃縮形成foci，并主導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒的生成(圖2D-圖2F)，顆粒中含有酵母應(yīng)激顆粒的標(biāo)記物Pab1 (圖2G&圖2H)，以及mRNA(圖2I)。

圖2 D：不同溫度下Rim4隨時(shí)間推移形成foci；E：圖1D中不同溫度下信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差；F：圖1D中不同溫度下細(xì)胞內(nèi)的平均foci數(shù)量；G&H：加熱后與未加熱的Pab1和Rim4的共定位；I：加熱后與未加熱的FISH結(jié)果。

Rim4含有三個(gè)RNA識別基序(RRM)，由內(nèi)在無序區(qū)域(IDR)連接，而IDR能夠引導(dǎo)Rim4 foci的形成。IDR殘基Rim4 (IDR₃)在細(xì)胞沒有因溫度升高導(dǎo)致應(yīng)激時(shí)也可以聚集形成foci，而C端IDR切除后的Rim4(△IDR₃)在溫度升高時(shí)的foci形成明顯下降，以上結(jié)果說明Rim4在沒有mRNA時(shí)也可以由IDR引導(dǎo)自組裝形成foci(圖3)。

圖3 上：GFP-Rim4，GFP-Rim4(?IDR3)和GFPRim4(IDR₃)的示意圖；下：上述Rim4及變體在加熱前和加熱后的分布。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管Rim4在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均等分布，溫度升高時(shí)生成foci的主要是細(xì)胞質(zhì)中的Rim4。研究人員使用了具有RNA結(jié)合缺陷的Rim4(FLm)突變體，其僅有一個(gè)功能正常的RRM，相對于野生型的RNA結(jié)合下降，但不會自組裝。加熱后，細(xì)胞核中的Rim4(FLm)迅速形成了foci(圖4)，這說明RNA結(jié)合能夠抑制Rim4的自組裝。

圖4: 加熱后細(xì)胞核中Rim4(FLm)形成foci。

根據(jù)以上結(jié)果，研究人員使用了一個(gè)熱誘導(dǎo)產(chǎn)生減數(shù)分裂應(yīng)激顆粒的模型(圖5)。

圖5 Rim4自組裝后結(jié)合RNA和RBP形成應(yīng)激顆粒的過程

在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Rim4 foci形成的開始階段(42?C, 10 sec)，與Pab1幾乎沒有共定位；Rim4 foci完整形成后(42?C, 5 min)，能夠與Pab1結(jié)合(圖6)。

圖6 加熱時(shí)，Rim4首先形成foci，然后與Pab1結(jié)合。

最后，研究人員檢測了溫度升高導(dǎo)致的Rim4自組裝和減數(shù)分裂應(yīng)激顆粒的生成對減數(shù)分裂和孢子形成的影響。結(jié)果表明，減數(shù)分裂間期Ⅰ細(xì)胞的細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白Atg8與Rim4 foci在溫度變化及回復(fù)期間均未發(fā)生共定位；不同時(shí)期的細(xì)胞裂解后，裂解液中的Rim4蛋白水平在加熱過程中和加熱后恢復(fù)時(shí)沒有改變（圖7），說明Rim4的濃縮能夠使其在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)也能夠保持穩(wěn)定，直到減數(shù)第一次分裂時(shí)再分解，進(jìn)而啟動(dòng)減數(shù)分裂中后期的翻譯過程。

為了更好的為國內(nèi)科研工作者提供專業(yè)技術(shù)支持和服務(wù)，Quantum Design中國北京樣機(jī)實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了 VAHEAT 超精準(zhǔn)可調(diào)節(jié)溫度控制模塊，為您提供樣品測試、樣機(jī)體驗(yàn)等機(jī)會，期待與您的合作！  歡迎您通過電話：010-85120277/78、郵箱：info@qd-china.com或掃描下方二維碼聯(lián)系我們。