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李珊

在發(fā)現(xiàn)潛在蛋白生物標(biāo)志物之后，需要通過(guò)靶向蛋白組學(xué)定量技術(shù)在大生物樣本量中，進(jìn)行高通量、高準(zhǔn)確性、可重復(fù)性的檢測(cè)，來(lái)驗(yàn)證這些標(biāo)志物。目前，靶向蛋白定量檢測(cè)技術(shù)主要包括免疫分析和質(zhì)譜分析。傳統(tǒng)的免疫法如ELISA，存在目標(biāo)物通量低、靈敏度有限、交叉反應(yīng)等不足，一些新型免疫檢測(cè)平臺(tái)則存在成本和技術(shù)門(mén)檻高、新方法開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。質(zhì)譜靶向檢測(cè)主要包括基于三重四極桿的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）方法。與MRM相比，PRM的優(yōu)勢(shì)在于它可以通過(guò)單次掃描即可監(jiān)測(cè)目標(biāo)母離子的所有產(chǎn)物離子，無(wú)需在數(shù)據(jù)采集之前預(yù)先設(shè)計(jì)母子離子對(duì)，簡(jiǎn)化了方法開(kāi)發(fā)工作流程，并且可提高檢測(cè)靈敏度。Heil等¹在Orbitrap Eclipse質(zhì)譜儀上多次測(cè)量126個(gè)血漿蛋白中的432個(gè)肽，在高分辨率Orbitrap和單位分辨率線(xiàn)性離子阱（LIT）之間交替進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種質(zhì)量分析器具有相似的技術(shù)精度，并且線(xiàn)性離子阱的優(yōu)越靈敏度使其在超過(guò)62%的肽中測(cè)得更低的定量下限。

圖1. Orbitrap與LIT PRM檢測(cè)對(duì)比

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下面我們一起來(lái)看看Stellar發(fā)布以來(lái)在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方向的應(yīng)用研究報(bào)道結(jié)果。

Remes等²對(duì)比了血漿基質(zhì)中786條多肽的三重四極桿和Stellar質(zhì)譜靶向定量檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與MRM檢測(cè)結(jié)果相比，Stellar PRM檢測(cè)的定量下限（LOQ）和檢測(cè)下限（LOD）分別提高了~10倍和~2倍，展現(xiàn)出更高的靈敏度。

圖3. MRM和Stellar PRM檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

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Plubell等³利用Orbitrap OE480或Stellar質(zhì)譜建立基質(zhì)樣本GPF-DIA蛋白組學(xué)譜圖庫(kù)；通過(guò)集成在skyline軟件中的PRM Conductor工具優(yōu)化每個(gè)precursor的色譜和質(zhì)譜參數(shù)，以及篩選precursor的m/z和相對(duì)保留時(shí)間；利用引入Adaptive RT功能的Stellar質(zhì)譜儀進(jìn)行篩選后precursors的PRM檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了利用Stellar進(jìn)行生物液體樣本高通量靶向蛋白檢測(cè)的方法（圖4）。在神經(jīng)退行性疾病病人來(lái)源的腦脊液樣本中進(jìn)行基于前期研究和GPF-DIA篩選得到的共101個(gè)蛋白（1070個(gè)precursors）的PRM檢測(cè)，通過(guò)Tau、APOE4等明確與AD相關(guān)的蛋白檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的可信度（圖5）；另外對(duì)病人血漿樣本進(jìn)行直接基于GPF-DIA篩選得到的共723個(gè)蛋白（2096個(gè)precursors）的PRM檢測(cè)，并成功驗(yàn)證出已報(bào)道的PD相關(guān)差異（圖6）。

Wahle等⁴開(kāi)發(fā)報(bào)道了基于Orbitrap Astral的DIA數(shù)據(jù)建立Stellar PRM方法的分析策略（圖7），以及利用¹⁵N標(biāo)記蛋白在Stellar質(zhì)譜上開(kāi)發(fā)蛋白panel的準(zhǔn)確定量方法（圖8），使包括翻譯后修飾和突變?cè)趦?nèi)的蛋白質(zhì)形態(tài)的研究成為可能，展示出Stellar在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方面的能力和潛力。

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