固相篩選法就是將純化或充足的抗原包被在固相介質(zhì)上（如酶標(biāo)板、親和層析柱和免疫試管），然后再加入帶篩選的噬菌體抗體庫孵育，經(jīng)過多次“吸附-洗滌-解離-擴(kuò)增”的過程，洗去非特異性結(jié)合或結(jié)合力弱的噬菌體抗體，回收結(jié)合上的噬菌體抗體。下面是一些固相篩選實(shí)驗(yàn)過程：

一．抗原、抗體結(jié)合時間的選擇

在包被抗原的ELISA板孔中，分別加入抗原噬菌體抗體以及非特異性的噬菌體抗體，結(jié)合時間可以設(shè)置1、10、20、30、45min及1、1.5、2h。用PBST洗滌5次后，加入1:5000 HRP-羊抗M13抗體，再加入PBST洗滌5次，加HRP底物顯色液并終止后，測定A值。

二．洗滌條件的選擇

在包被抗原的ELISA孔板中，分別加入上述類型的噬菌體抗體，反應(yīng)2h后，采用不同的洗滌條件進(jìn)行洗滌，以PBST洗5次，以PBS和PBST各洗5次，以PBS洗5次后再以PBST洗10次，以PBS和PBST各洗10次，之后同上進(jìn)行噬菌體的ELISA檢測。

三．緩沖液pH的選擇

在包被抗原的ELISA板孔中，分別加入上述類型的噬菌體抗體，于37℃溫育2h。分別采用pH3、4、5、6的醋酸/醋酸鈉緩沖液洗滌10min后，同上進(jìn)行噬菌體抗體的ELISA檢測。

四．抗原包被濃度對篩選結(jié)果的影響

用濃度分別為1、2、4、6及8mg/L的抗原包板，加入100μL混合的噬菌體抗體，于37℃溫育2h。然后以PBST和PBS各洗板20次，加入100μL E coli TG1，于37℃溫育1h。然后稀釋105后涂板，置30℃培養(yǎng)過夜。從不同篩選條件所得的平板上各挑96個單菌落，進(jìn)行噬菌體抗體的競爭ELISA檢測。

五．噬菌體抗體的競爭ELISA法檢測

噬菌體抗體上清與等體積MPBS（含40 mLL牛奶的PBS）混合，室溫靜置30 min。同樣，將樣品與等體積含抗原的MPBS混合，室溫靜置30min。各取100μL加入到包被抗原的板中反應(yīng)1 h，以PBST洗滌5次。加入1:5 000 HRP-羊抗M13抗體，于37℃孵育1h；同上洗滌后，加HRP底物顯色液顯色15 min，以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，于波長450/620nm測定A值?？乖偁庍_(dá)到50%以上的克隆視為陽性，即有抗原競爭的A值為無抗原競爭的A值50%以下的克隆即為陽性。

六．洗滌過程產(chǎn)生的影響

嚴(yán)謹(jǐn)度過高，可使一些表達(dá)較低的克隆被篩掉,而這些克隆中可能含有親和性極高的目的噬菌體；嚴(yán)謹(jǐn)度過低，又可導(dǎo)致噬菌體的富集過程太慢，篩選輪數(shù)增加。考慮降低洗滌強(qiáng)度（PBS洗滌液中不加土溫）以及減少洗滌次數(shù)。

七．抗原濃度的確定

現(xiàn)在普遍認(rèn)為：低濃度的抗原應(yīng)優(yōu)先用于篩選高親和力的抗體，而高濃度的抗原則有利于低親和力抗體的篩選。需要注意的是，篩選用的抗原存在一個有效的濃度，不是所有用于包被的抗原都能有效的用于篩選，抗原的有效濃度必須要達(dá)到一定的值。但有效抗原濃度又不能高于10-6mol/L，此時反而會使特異性抗體的富集效果下降。

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