關(guān)鍵詞：靜態(tài)流動(dòng)模式、BSA蛋白、分子量分布

BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式適用于與凝膠滲透色譜GPC/SEC連接使用，其中GPC設(shè)備可以配置一個(gè)示差折光檢測(cè)器或者一個(gè)紫外檢測(cè)器，可以依賴(lài)于樣品組分的大小將每個(gè)組分分離，并依次流出。

BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式在90°使用PD檢測(cè)器收集樣品散射光強(qiáng)度信號(hào)，并同時(shí)收集示差折光檢測(cè)器或者紫外檢測(cè)器信號(hào)，結(jié)合這兩個(gè)信號(hào)計(jì)算得到每個(gè)流出組分的絕對(duì)分子量和分子量分布信息。由于BeNaon采用的是單角度靜態(tài)光散射，根據(jù)瑞利散射理論，只要分子大小不超過(guò)波長(zhǎng)1/40，結(jié)果的準(zhǔn)確性都能夠得到保證，這尤其適合蛋白質(zhì)類(lèi)樣品的檢測(cè)。BeNano對(duì)于不同種類(lèi)樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)上限如下表：

在這個(gè)應(yīng)用中，我們將BeNano主機(jī)與SEC前端相連接，檢測(cè)了BSA牛血清蛋白樣品的分子量和分子量分布信息。

原理和設(shè)備

前端凝膠色譜中使用了市場(chǎng)中某主流品牌SEC，具有RI檢測(cè)器，使用TSK氧化硅柱進(jìn)行分離。

測(cè)試采用丹東百特BeNano 180 Zeta Max納米粒度及Zeta電位分析儀，儀器使用波長(zhǎng)671 nm、功率50 mW激光器作為光源，在90°進(jìn)行光散射信號(hào)收集。測(cè)試使用了27μL 低容量流通池作為檢測(cè)池。利用BFC-1信號(hào)采集器收集前端SEC設(shè)備的示差折光檢測(cè)器輸出的模擬信號(hào)。

樣品制備和測(cè)試條件

將BSA分散在pH=7的PBS緩沖液中，配置濃度為5mg/mL。進(jìn)樣量100 μL，流速為0.7mL/min。

通過(guò)前端SEC進(jìn)行進(jìn)樣，分離。分離后的樣品組分逐一進(jìn)入RI檢測(cè)器和BeNano進(jìn)行信號(hào)收集。BeNano溫度控制在25℃，基本與室溫一致。

測(cè)試結(jié)果和討論

圖1可以看出，BSA樣品經(jīng)過(guò)色譜柱分離得到若干個(gè)流出峰，說(shuō)明BSA在PBS中形成一系列團(tuán)聚狀態(tài)。對(duì)于RI和光散射信號(hào)進(jìn)行基線(xiàn)設(shè)定和積分線(xiàn)設(shè)定，得到每一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的分子量，得到的分子量列于表1中。

圖2為對(duì)于整體信號(hào)積分得到的整體分子量流出曲線(xiàn)。通過(guò)分子量隨流出體積曲線(xiàn)可以看出，分子量隨著流出體積逐漸降低，這符合凝膠色譜的分離原理。在每一個(gè)峰內(nèi)，分子量均形成平臺(tái)，這符合蛋白質(zhì)每個(gè)峰內(nèi)某種寡聚狀態(tài)的分子量都分布極窄的特征。

通過(guò)表1每個(gè)峰的分子量可以看出，峰1（最后的流出峰）的分子量為66K，這與BSA的理論分子量一致，峰2-4的分子量均為峰1的倍數(shù)，說(shuō)明峰2-4分別為二聚體、三聚體和四聚體。

結(jié)論

在該應(yīng)用報(bào)告中，利用BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式檢測(cè)了BSA樣品的分子量信息。通過(guò)結(jié)果可以看出，BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式可以分別準(zhǔn)確地得到一系列BSA樣品流出峰的分子量，通過(guò)分子量值可以準(zhǔn)確判斷出各個(gè)流出峰對(duì)應(yīng)的團(tuán)聚狀態(tài)。