在園藝和植物科學(xué)領(lǐng)域,延長(zhǎng)花卉的花期一直是研究的熱點(diǎn)和挑戰(zhàn)。近期,一項(xiàng)關(guān)于日本牽?;ɑㄆ谘娱L(zhǎng)的研究引起了廣泛關(guān)注。研究團(tuán)隊(duì)使用AlphaScreen技術(shù)建立了一個(gè)高通量篩選系統(tǒng),對(duì)一個(gè)包含9,600種化合物的文庫(kù)進(jìn)行了篩選,以尋找能夠抑制EPH1-DNA相互作用的化合物,通過(guò)篩選成功地發(fā)現(xiàn)了兩種抑制花瓣衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子EPH1的DNA結(jié)合活性的化合物,從而顯著延長(zhǎng)了花卉的花期。
EPH1是一個(gè)NAM/ATAF1,2/CUC2(NAC)轉(zhuǎn)錄因子,是花瓣衰老過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,對(duì)花瓣衰老過(guò)程中的程序性細(xì)胞死亡(PCD)起著關(guān)鍵作用。
研究人員首先合成了帶有C末端AGIA標(biāo)簽的EPH1蛋白,并確定了EPH1與其靶標(biāo)DNA(VPE序列)的結(jié)合。通過(guò)AlphaScreen技術(shù),他們檢測(cè)到了EPH1與VPE DNA之間的強(qiáng)烈信號(hào),而與突變的VPE DNA(mVPE)的結(jié)合則產(chǎn)生了很低的信號(hào),表明該系統(tǒng)能夠有效地檢測(cè)EPH1與特定DNA序列的相互作用。
圖1:EPH1與DNA相互作用的高通量分析系統(tǒng)的建立以及EPH1抑制劑的篩選流程。使用AlphaScreen技術(shù),用于檢測(cè)使用AGIA標(biāo)記的EPH1蛋白與生物素標(biāo)記的其靶標(biāo)DNA之間的作用。
接著,研究人員利用這一系統(tǒng)對(duì)一個(gè)包含9,600種化合物的文庫(kù)進(jìn)行了篩選,以尋找能夠抑制EPH1-DNA相互作用的化合物。他們發(fā)現(xiàn)了Everlastin1和Everlastin2,這些化合物能夠抑制EPH1與DNA的結(jié)合,并顯著延遲花瓣的衰老。通過(guò)進(jìn)一步的分析,研究人員發(fā)現(xiàn)這些化合物通過(guò)抑制EPH1的二聚化來(lái)發(fā)揮作用,從而阻止了EPH1與DNA的結(jié)合。
圖2:第一輪篩選中得到的化合物結(jié)果:G1、G2和G3類似物的抑制EPH1-DNA相互作用活性的測(cè)試結(jié)果,化合物對(duì)花瓣衰老的影響,以及它們對(duì)花瓣蛋白含量的影響。
圖3:AlphaScreen技術(shù)檢測(cè)Everlastin1和Everlastin2對(duì)EPH1與DNA相互作用及對(duì)EPH1蛋白二聚化的影響的影響:EPH1全長(zhǎng)蛋白(EPH1-FL)與VPE DNA的相互作用的影響,EPH1 DNA結(jié)合域(EPH1-DBD)與VPE DNA的相互作用的影響。
通過(guò)RNA測(cè)序分析顯示,這些化合物的處理強(qiáng)烈抑制了與程序性細(xì)胞死亡和自噬相關(guān)的基因表達(dá)。這些結(jié)果表明,針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的化學(xué)方法可以調(diào)節(jié)花瓣衰老,為延長(zhǎng)觀賞植物的花期提供了新的化學(xué)策略。
圖4:Everlastin1和Everlastin2處理的花瓣的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和轉(zhuǎn)錄組分析:使用抗EPH1抗體進(jìn)行的ChIP-qPCR分析,以及Everlastin1處理對(duì)基因表達(dá)的影響。
研究人員通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和生物測(cè)定,進(jìn)一步證實(shí)Everlastin1和Everlastin2處理能夠延遲花瓣衰老的進(jìn)程,驗(yàn)證了這些化合物在延遲花瓣衰老方面的效果,這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物花瓣衰老的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解,而且為開(kāi)發(fā)延長(zhǎng)觀賞植物花期的化學(xué)制劑提供了可能。
圖5:Everlastin1和Everlastin2對(duì)花瓣衰老的影響。圖中展示了這些化合物對(duì)花瓣可見(jiàn)衰老的時(shí)間進(jìn)程、蛋白含量、DNA降解以及花瓣面積的影響。
進(jìn)一步分析與應(yīng)用:研究還探討了這些化合物可能對(duì)其他轉(zhuǎn)錄因子(如NAC TFs)的影響,并提出了進(jìn)一步研究這些基因以增強(qiáng)對(duì)花瓣衰老分子機(jī)制的理解。此外,研究團(tuán)隊(duì)還考慮了這些化合物可能對(duì)其他轉(zhuǎn)錄因子和/或過(guò)程的影響及其在農(nóng)業(yè)和園藝領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用中的潛力,如通過(guò)噴灑或浸泡處理來(lái)延長(zhǎng)盆栽或切花的花期。
在這項(xiàng)研究中,瑞孚迪()公司的先進(jìn)技術(shù)和儀器發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。
瑞孚迪的高通量篩選系統(tǒng)
利用Envision多功能酶標(biāo)儀搭配AlphaScreen技術(shù)檢測(cè)。
Flexdrop納升級(jí)分液器用于384孔AlphaPlate液體分配。
研究團(tuán)隊(duì)利用瑞孚迪的高通量篩選系統(tǒng),對(duì)9,600種合成的化合物進(jìn)行了篩選,尋找到了目標(biāo)化合物。瑞孚迪高通量篩選系統(tǒng)的高效性和精確性為研究提供了強(qiáng)有力的支持,確保了篩選過(guò)程的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)這一系統(tǒng),研究團(tuán)隊(duì)成功地識(shí)別出了能夠顯著延遲花瓣衰老的化合物,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)于Envision多功能酶標(biāo)儀
更快的速度、通量和靈敏度
EnVision多模式微孔板檢測(cè)儀具有更快的速度、更高通量和所有檢測(cè)技術(shù)中的上佳靈敏度。作為高通量篩選的金標(biāo)準(zhǔn),EnVision微孔板檢測(cè)儀以更高靈敏度和通量,始終如一地為您提供強(qiáng)大的檢測(cè)性能和穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。
集多項(xiàng)成熟技術(shù)于一身
標(biāo)準(zhǔn)EnVision系統(tǒng)可檢測(cè)所有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù):
吸光度
熒光強(qiáng)度
化學(xué)發(fā)光,包括輝光型化學(xué)發(fā)光、閃光性化學(xué)發(fā)光和雙報(bào)告基因化學(xué)發(fā)光
時(shí)間分辨熒光(TRF)和TR-FRET,包括我們的DELFIA、LANCE和LANCE Ultra技術(shù),以及HTRF?和LanthaScreen?
熒光偏振
提高性能、容量和通量
我們的 AlphaScreen和AlphaLISA激光檢測(cè)
技術(shù),包括 AlphaPlex
超靈敏化學(xué)發(fā)光
TRF激光檢測(cè)模塊
四光柵模塊
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關(guān)于FlexDrop納升級(jí)分液系統(tǒng)
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參考文獻(xiàn)
1、Kenichi Shibuya,et al.A chemical approach to extend flower longevity of Japanese morning glory via inhibition of master senescence regulator EPHEMERAL1。Nature Plants。10 , 1377–1388,(2024).
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