放大培養(yǎng)過(guò)程中使用Setpoint Table對(duì)補(bǔ)料流速進(jìn)行程序化自動(dòng)控制，使用Lookup Table將DO與攪拌、空氣、氧氣全自動(dòng)關(guān)聯(lián)。

另外，XDR 200 MO反應(yīng)器的槳葉設(shè)計(jì)（上層Pitch軸流槳、下層Rushton槳）也為高密度菌體發(fā)酵培養(yǎng)提供有效的支持。

我們的研究成果證實(shí)了XDR 200 MO反應(yīng)器對(duì)上游大腸桿菌培養(yǎng)的適用性，為基因治療等行業(yè)的質(zhì)粒生產(chǎn)提供有效手段。

基因治療包括mRNA和DNA疫苗這些新興療法都會(huì)使用到質(zhì)粒，這些質(zhì)?；径际峭ㄟ^(guò)大腸桿菌發(fā)酵而得。

一般而言，病毒載體和mRNA所需要的質(zhì)粒生產(chǎn)規(guī)模為百升級(jí)別。一次性反應(yīng)器快速的批間切換能力以及降低交叉污染風(fēng)險(xiǎn)的特性，更適用于多種質(zhì)粒的快速放大生產(chǎn)。

這篇文章的主要目的是：

建立質(zhì)粒放大生產(chǎn)工藝；

考察XDR 200 MO反應(yīng)器在160 L規(guī)模下質(zhì)粒的放大生產(chǎn)性能；

確認(rèn)XDR 200 MO與5 L玻璃罐在質(zhì)粒產(chǎn)量和SC比例方面是否具有可比性。

5 L玻璃發(fā)酵罐的初始接種密度OD₆₀₀為0.02，初始培養(yǎng)體積2.5 L。

在接種8.7 h后，DO值降低至設(shè)定值30%，之后開(kāi)啟級(jí)聯(lián)溶氧的空氣和氧氣的自動(dòng)調(diào)節(jié)控制。初始的補(bǔ)料速率為0.2 mL/min，之后每1.5-2 h調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率以維持菌體比生長(zhǎng)速率在0.06-0.08 h^-1。

生長(zhǎng)曲線如圖1所示，培養(yǎng)后期最高OD₆₀₀達(dá)到89.2。

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每4小時(shí)留樣一次，并且儲(chǔ)存于-20℃冰箱中。樣品檢測(cè)之前先解凍，并且稀釋至1.0至1.5 OD之間，通過(guò)分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖1B）分析質(zhì)粒產(chǎn)量和SC超螺旋比例。

在瓊脂糖凝膠電泳圖片中，SC質(zhì)粒為3000 bp標(biāo)記物遷移，而開(kāi)環(huán)形（OC）質(zhì)粒為4000 bp標(biāo)記物遷移，SC比例為92.2%。

發(fā)酵過(guò)程放大至200 L規(guī)模所使用的通氣策略與5 L反應(yīng)器保持一致，采用相同的VVM，即每分鐘通氣量與培養(yǎng)體積的比例保持一致，最高VVM控制在0.2-0.3之間。

初始接種密度為0.02 OD₆₀₀，初始體積為68 L。DO設(shè)定值30%，級(jí)聯(lián)空氣與氧氣流速。當(dāng)氧氣流速達(dá)到9-10 Lpm，提高轉(zhuǎn)速15 rpm以維持DO。

在接種后的6.5小時(shí)，DO值第一次降低至30%，此時(shí)空氣和氧氣開(kāi)啟級(jí)聯(lián)，以自動(dòng)控制溶氧至30%。

發(fā)酵18小時(shí)后開(kāi)啟補(bǔ)料，初始速率為5.6 mL/min，之后每1.5-2 h調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率，以維持菌體比生長(zhǎng)速率在0.06-0.08 h-1(圖2)。

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160 L培養(yǎng)體積下的攪拌以及補(bǔ)料控制都與之前批次相同。XDR 200 MO反應(yīng)器采用先進(jìn)的DO控制模式。

在DO控制回路中，您可以根據(jù)DO值不同的CV（控制變量）級(jí)聯(lián)到空氣流速、O₂流速和攪拌速率（圖4A）。

這種終端用戶可根據(jù)工藝需求自我靈活配置的策略不僅能穩(wěn)定DO，還能有效控制泡沫以及袋壓。

在該批次中，DO完全自動(dòng)控制，并使用Lookup Table級(jí)聯(lián)到空氣流速、O₂流速和攪拌轉(zhuǎn)速（圖4B）。

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此次實(shí)驗(yàn)中，使用Setpoint Table對(duì)補(bǔ)料速率進(jìn)行程序化自動(dòng)控制（圖4C），培養(yǎng)中的最大補(bǔ)料速率為35 mL/min（Step_12），整個(gè)過(guò)程中的補(bǔ)料速率都自動(dòng)調(diào)整并記錄在控制軟件中，降低了人為操作的風(fēng)險(xiǎn)并且更滿足生產(chǎn)法規(guī)需求。

溶氧的控制采用自動(dòng)化級(jí)聯(lián)模式（圖4A、圖4B），以維持穩(wěn)定的溶氧狀態(tài)。

發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵工藝參數(shù)如圖5所示，這些工藝參數(shù)（DO-藍(lán)線、pH-綠線、溫度-紅線）在整個(gè)過(guò)程中非常穩(wěn)定，且波動(dòng)很小。在該體積培養(yǎng)下，這些參數(shù)都能得到很好的控制，以此體現(xiàn)XDR 200 MO穩(wěn)定且高效的參數(shù)控制性能。

整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率控制菌體比生長(zhǎng)速率在0.06-0.08 h^-1，最終收獲液為167 kg，OD₆₀₀達(dá)到95.8（圖6A），SC比例為91.75%。

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5 L玻璃反應(yīng)器和XDR 200 MO反應(yīng)器（裝液量80 L、160 L）能達(dá)到的最高OD₆₀₀分別是89.2、93.4、95.8。質(zhì)粒均一化產(chǎn)量和SC比例如表1所示。

XDR 200 MO反應(yīng)器能提供高kLa，支持大腸桿菌的高密度發(fā)酵，本實(shí)驗(yàn)中最高OD₆₀₀可達(dá)到95。

XDR 200 MO能重現(xiàn)5 L 規(guī)模的發(fā)酵結(jié)果，達(dá)到具有可比性的OD₆₀₀、質(zhì)粒產(chǎn)量和超螺旋質(zhì)粒比例（SC%），具有好的放大重現(xiàn)性。

XDR 200 MO在培養(yǎng)過(guò)程中能保持溶氧、pH、溫度等重要工藝參數(shù)穩(wěn)定，滿足培養(yǎng)需求。