前言

黃曲霉毒素（Afatoxin，AF）作為黃曲霉和寄生曲霉的一類次級代謝產(chǎn)物，最早發(fā)現(xiàn)于20世紀60年代?，F(xiàn)階段已知其衍生產(chǎn)物約20余種（B1、B2、G1、G2、M1、M2等），廣泛存在于藥材中。

值得關注的是，黃曲霉毒素一直被世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)（其中B1毒性最強），所以國際上對于霉菌毒素含量都有非常嚴格的限量要求。

目前，對于藥材中B族和G族黃曲霉毒素的檢測方法，主要參考如下標準：

《中國藥典》2020版，2351通則（具體項目見表1）

對于常規(guī)反相液相色譜，由于所用的溶劑（水、甲醇、乙腈）會使黃曲霉毒素B1和G1發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，很難直接測定。所以為了克服這一現(xiàn)象，通常選用柱前或柱后衍生的方式，來增加B1和G1的熒光響應值，以滿足檢測標準的需求。

目前常見的衍生方法有：TFA（三氟乙酸）柱前衍生法、柱后溴/碘試劑衍生法、柱后光化學衍生法以及柱后電化學衍生法。其中柱前衍生前處理過程較復雜、自動化程度低，所以現(xiàn)在主流方式為柱后衍生法，操作簡單，靈敏度高。

本應用介紹了三種柱后衍生方案，使用賽里安LC6000高效液相色譜儀，配備高靈敏度的熒光檢測器（FL 6440）。三種方案均能滿足檢測標準的需求，而從使用便捷性和靈敏度方面考慮，柱后光化學衍生法更為簡便。

▼ 表1  2020版《中國藥典》檢測黃曲霉毒素的藥材品種

柱后碘衍生方案

參照2020年新版《中國藥典》2351通則中真菌毒素測定法，以0.05%的碘溶液為衍生試劑，使用賽里安 LC6000高效液相色譜儀四元梯度系統(tǒng)，搭配熒光檢測器和柱后衍生單元測定四種黃曲霉毒素。

色譜條件

標準譜圖示例

從譜圖可以看出，使用柱后碘衍生法測定，四種黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2得到了很好的分離，分離度均大于1.5，滿足藥典要求。

得益于賽里安 FL6440 高靈敏度的熒光檢測器，四種黃曲霉毒素的最低檢出限遠小于2020藥典所規(guī)定的B1、G1檢出限0.5μg/kg（約0.30ng/mL）以及B2、G2檢出限0.2μg/kg（約 0.12ng/mL）。

▲ 柱后碘衍生法標樣譜圖

▲ 柱后碘衍生法檢出限譜圖

柱后溴衍生方案

參考柱后溴衍生的檢測方法，使用50mg/L三溴化吡啶作為衍生試劑，同樣采用賽里安LC6000高效液相色譜儀四元梯度系統(tǒng)，搭配熒光檢測器和柱后衍生單元測定四種黃曲霉毒素。

色譜條件

標準譜圖示例

使用與碘衍生法相同濃度的標準品溶液，但是進樣量有所差異。結(jié)果可見，B1、B2、G1、G2四種黃曲霉毒素同樣實現(xiàn)了基線分離。

從檢出限上看，B1和G1檢出限為0.03μg/kg（約0.075ng/mL），B2和G2檢出限為0.01μg/kg（約0.025ng/mL），實驗結(jié)果完全滿足。

▲ 柱后溴衍生法標樣譜圖

▲ 柱后碘衍生法檢出限譜圖

柱后光化學衍生方案

與柱后溴/碘試劑衍生相比，柱后光化學衍生具備更好的易用性。配置上光衍生單元連接于色譜柱和熒光檢測器中間即可直接使用，同時無需配制任何化學試劑。操作簡便的同時，靈敏度也能得到有效保證，特別適用于大量樣品的常規(guī)分析測定。

色譜條件

標準譜圖示例

配制標準系列工作溶液：黃曲霉毒素B1和G1濃度0.1~50ng/mL、B2和G2濃度0.03~15ng/mL。按上述測試條件測試并建立標準曲線（如圖所示），黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準工作曲線線性相關性r2均為 0.9999。

可見，采用柱后光化學衍生結(jié)合熒光檢測器進行測定，可以滿足法規(guī)對于黃曲霉毒素的檢測需要，并且相比其他方法更易與操作。

▲ 黃曲霉毒素B1和G1的標準曲線

▲ 黃曲霉毒素B2和G2的標準曲線

▲ 柱后光化學衍生法標樣譜圖

▲ 柱后光化學衍生法檢出限譜圖

結(jié)論

本應用介紹了三種柱后衍生方案，均使用賽里安LC6000高效液相色譜儀（配備高靈敏度的熒光檢測器）。實驗結(jié)果可靠，且能夠滿足各項標準對于黃曲霉毒素檢測的靈敏度要求，尤其是對藥材在生產(chǎn)儲存過程中的品質(zhì)把控提供了解決方案。

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