肽的純度、含量、總重與實(shí)際重量

根據(jù)總重和HPLC分析的純度，樣品中目的肽的含量是如何確定的呢？我公司的多肽發(fā)貨時(shí)是以總 重來計(jì)算的，也就是肽凍干后的實(shí)際重量，其中包括在凍干過程中，其它雜質(zhì)如殘留的水分、來自帶相 反電荷離子的鹽分等的重量。 肽的純度是指在波長214nm時(shí)樣品中目的肽所占的比例，樣品中可能含有缺失序列、短片段、脫保 護(hù)不完全的序列等等。肽的純度是在肽的Zda吸收峰214nm處由HPLC分析而得到的，肽中一般還含有 水分和鹽分，但肽的純度沒有把它們計(jì)算在內(nèi)。 肽的含量是指所有肽在樣品中所占的百分比，樣品中包含所有的肽及水分、鹽分等，肽的含量通過 氨基酸分析得到。 目的肽的含量是指在樣品中目的肽的純度與其含量的乘積。

肽的溶解性

以我們的經(jīng)驗(yàn)，溶解肽是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)。如果溶解不當(dāng)可能導(dǎo)致肽損失或者實(shí)驗(yàn)失敗。肽的溶 解性主要取決于肽的序列，所以，如果實(shí)驗(yàn)允許，肽序列中至少應(yīng)包含20%的帶電殘基以增加其溶解度。 在使用之前，客戶可以遵循以下三個(gè)基本原則來選擇合適的溶劑溶解多肽。首先，所選溶劑一定能 充分溶解多肽；其次，所選溶劑能與實(shí)驗(yàn)條件兼容；Z后，所選溶劑不能與肽反應(yīng)，也不能使肽降解。只 要肽的量允許，可以先用少部分肽溶解，然后再將全部樣品溶解。如果需要從溶劑中回收肽，可以選擇 一種初始溶劑使其在凍干后容易去除。 以下建議或許對(duì)您溶解肽有所幫助： 1. 少于5個(gè)氨基酸的肽一般溶于水溶液，強(qiáng)疏水的氨基酸（W，I，L，F(xiàn)，M，V，Y）除外。 2. 如果帶電氨基酸平均分布于全部序列中，那么含有>25%帶電氨基酸（E，D，K，R，H）的親水肽 和含有<25%疏水氨基酸的肽一般都能溶于水溶液。多肽的純化系統(tǒng)一般為0.1%TFA/水和0.1%TFA/ ACN。因此，如果肽溶解在沒有緩沖能力或者緩沖能力很弱的緩沖液中，結(jié)果可能導(dǎo)致肽溶液呈酸 性。在使用別的方法溶解肽時(shí)務(wù)必使溶劑的pH值近乎中性。酸性肽（E+D殘基數(shù)多于K+R+H殘基 數(shù)）和堿性肽（K+R+H殘基數(shù)多于E+D殘基數(shù)）在中性pH值條件下比在酸性pH值下更易于溶解。 3. 對(duì)于疏水氨基酸含量為50%～75%的肽，即使序列中含有>25%帶電氨基酸也有可能不溶于水或者 部分溶解。best先把肽溶于Z少量的強(qiáng)有機(jī)溶劑如DMF、ACN、異丙醇、乙醇、乙酸、4-8M GdnHCl、 尿素，或者DMSO（序列中沒有C，W，M時(shí)），及其它類似的有機(jī)溶劑中。best將溶解肽的有機(jī)溶 劑緩慢地逐滴加入水溶液中，如果溶液變渾濁，可能是達(dá)到了溶解極限，繼續(xù)溶解就沒什么用了。 需要注意的是，Z開始選擇的溶劑應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)兼容。 4. 疏水氨基酸含量>75%的強(qiáng)疏水肽一般也不溶于水溶液。此類肽也應(yīng)該先用強(qiáng)有機(jī)溶劑（如TFA，甲 酸）溶解，如果將其加入到水溶液中也可能產(chǎn)生沉淀。Z后的肽溶液可能需要高濃度的有機(jī)溶劑使 之變性，而有機(jī)溶劑一般不用于活細(xì)胞的生物功能研究。 5. S，T，E，D，K，R，H，N，Q，Y含量高（>75%）的多肽序列容易形成多余的分子間氫鍵網(wǎng)絡(luò)， 在濃的水溶液中容易形成凝膠。此類肽可以用步驟3所述方法溶解。 為了減少溶解中可能出現(xiàn)的問題，建議客戶從設(shè)計(jì)上和序列上多加考慮，以改善肽的溶解度。

肽的溶解方法

用哪種溶劑溶解合成肽一直是困擾多肽工作者的一個(gè)難題。根據(jù)不同的氨基酸序列，可以參考以下 方法來溶解合成肽。best是先將少量肽用水溶液溶解，不要一次將全部樣品都溶解掉。 1. 將酸性氨基酸Asp (D)，Glu (E)和C端-COOH的值定為-1。 2. 將堿性氨基酸Arg (R)，Lys (K)，His (H)的值定為+1。 3. 計(jì)算肽中全部電荷量。 4. 如果肽的全部電荷為正值，則肽呈堿性，可以先用水溶解。如果肽不溶于水，可以用10%乙酸或者 更高濃度的乙酸溶解。如果肽一點(diǎn)都不溶，加入TFA(<50ml)助溶，并用去離子水稀釋至1ml。 5. 如果肽的全部電荷為負(fù)值，則肽呈酸性，可以先用水溶解。如果肽不溶于水，加入NH4OH(<50ml) 助溶，并用去離子水稀釋至1ml。 6. 如果肽的全部電荷為0，則肽呈中性。中性肽需要用乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑來溶解，也可 以加入變性劑（如尿素、鹽酸胍等）?！?/span>

實(shí)例：　　　　KRLMKSIEVIMPL: (+4) + (-2) = +2。此條肽呈堿性。見以上步驟4。

　　　　　　　LVKMKSIEDPDCE: (+3) + (-5) = -2。此條肽呈酸性。見以上步驟5。

　　　　　　　MVSRKDLVEHRDM: (+4) + (-4) = 0。此條肽呈中性。見以上步驟6。

肽的貯存

貯存時(shí)間太長的多肽樣品可能出現(xiàn)一些問題。凍干多肽通常穩(wěn)定性較好，一般來講凍干多肽在-10℃ 或更低溫度條件下能貯存幾年而不會(huì)降解。但如果以溶液狀態(tài)保存，其穩(wěn)定性就會(huì)受到影響。由于多肽會(huì)被微生物、細(xì)菌和蛋白酶降解，因此best用無菌溶液溶解多肽，可以用無菌水、蒸餾水溶解，或者溶 解后過濾CJ。對(duì)于那些含有Met、Cys、Trp的肽，由于氧化作用會(huì)產(chǎn)生其它雜質(zhì)或使其喪失生物學(xué)活 性，因此，含有上述氨基酸的肽應(yīng)該用無氧溶劑溶解。 關(guān)于溶劑的pH，多數(shù)肽在酸性條件下比較穩(wěn)定。建議溶劑的pH范圍為3～6，溶解的多肽best分裝 后冷凍保存，避免反復(fù)凍融。為保持肽的穩(wěn)定性，建議多肽best以凍干粉狀態(tài)保存。

常見問題及參考意見

Q：國肽生物對(duì)本公司的產(chǎn)品是如何監(jiān)控的？

A ：所有合成肽都經(jīng)過HPLC和MS分析，除MALDIMS 外，由于肽在不同的質(zhì)譜儀中，能按其本身 的序列進(jìn)行離子化，我們可以運(yùn)用HPLC-MS技 術(shù)對(duì)HPLC中那些離子化的峰進(jìn)行分析。我公司 的技術(shù)裝備[MALDI-MS，HPLC-(ESI)MS（離 子阱和四極管陣列）]為分析提供可靠的保證。

Q：請(qǐng)介紹一下你們的純化策略

A：我公司合成的多肽是用制備型反相HPLC進(jìn)行 純化的，所用的兩種流動(dòng)相中都添加了TFA，pH 2。A相是0.1% TFA于超純水中，B相是0.1% TFA 于ACN 中，pH 2。樣品可以直接用A相 溶，或者先用少量B相溶解再用A相稀釋。有 時(shí)可能需要用強(qiáng)溶劑如甲酸、乙酸來溶解疏水 肽，具體采用哪種方法要看肽序列。在pH 6.8 時(shí)一般很難將肽溶解也很難進(jìn)行純化，因此我 們一般是先將肽溶解再用兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度 洗脫。所用的pH 6.8的緩沖液為10 mM醋酸銨 于超純水中（流動(dòng)相A），純ACN（流動(dòng)相B）。 通過紫外檢測器在214 nm處檢測，收集不同組 分并用MADLI-TOF MS進(jìn)行成分鑒定，用反相 HPLC分析純度，然后把目的肽凍干，將凍干的 肽合并裝入小瓶中，Z后，再對(duì)合并后的產(chǎn)物進(jìn) 行MS和HPLC分析。

Q：如何解釋MALDI(MS)中的P+Na 和P+K峰？

A：經(jīng)常會(huì)在MALDI中看到Na峰和K峰，鈉和鉀 來源于溶劑水。即便是蒸餾水和去離子水也會(huì) 含有痕量的鈉離子和鉀離子，無法完全除去。它 們?cè)谶M(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)也會(huì)離子化并與肽的自由 羧基結(jié)合。因?yàn)闆]有純化水的系統(tǒng)將水中的鈉 離子和鉀離子除去，所以有時(shí)候在MALDI MS 圖譜中出現(xiàn)鈉峰和鉀峰也是再所難免的。

Q：合成肽在長度上有何限制？

A：我公司合成的多肽長度為6～50個(gè)氨基酸。標(biāo) 準(zhǔn)的固相合成程序一般能合成6～50個(gè)氨基酸 的多肽。

Q：肽的純度能達(dá)到多少？我的實(shí)驗(yàn)需要多少純度？

A：我公司可以提供不同的純度級(jí)別供客戶選擇， 從粗品到>98%純度。根據(jù)客戶需要我們可以提 供純度>98%的超純多肽。各種純度及應(yīng)用范圍 如下： >70%，用于免疫實(shí)驗(yàn)和不敏感的篩選實(shí)驗(yàn) >80%，用于免疫實(shí)驗(yàn)和不敏感的篩選實(shí)驗(yàn) >90%，用于SAR研究和生物檢測 >95%，用于NMR，晶體結(jié)構(gòu)研究及生物檢測 >98%，用于NMR，晶體結(jié)構(gòu)研究及敏感的生物 檢測

Q：什么是凈重？什么是肽含量？

A：肽凍干后一般呈現(xiàn)為蓬松的絨毛狀，由于肽本身 的特性決定了其中可能仍然含有痕量的水分、吸 附的溶劑及鹽分等。這不代表肽的純度不夠，僅 僅是影響肽的實(shí)際含量，使其降低了10%～30%。 肽的凈重是指肽的實(shí)際重量減去水分和質(zhì)子化離 子后的重量。為保證肽的濃度，需要從粗品肽中 把非肽物質(zhì)去除。

Q：國肽生物如何運(yùn)輸多肽？都提供哪些檢測報(bào)告？

A：所有凍干的多肽都盛放在2 ml或10ml的螺旋蓋 小塑料管里，都附帶有原始的分析數(shù)據(jù)和合成 報(bào)告單，上面包含有多肽的序列、分子量、純 度、重量、編號(hào)等重要信息。

Q：什么樣的保存條件是best的？多肽的穩(wěn)定性怎 樣？

A：多肽凍干后呈絨毛狀或絮狀粉末，可避免多肽 的過早降解。建議貯存條件為： a. -20℃貯存或者在干燥環(huán)境中貯存 b. 盡量避免反復(fù)凍融 c. 盡量避免以溶液狀態(tài)貯存（為使用方便可以 將凍干粉分裝后貯存） d. 如果必須以溶液狀態(tài)貯存，建議用無菌水在 弱酸性條件下溶解多肽并于-20℃貯存.

Q：如何溶解多肽？

A：多肽的溶解度主要取決于其一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，修飾標(biāo)記的性質(zhì)及溶劑類型和終濃度。如果 肽難溶于水，超聲可以助溶。對(duì)于堿性肽，建議 用1 0 % 乙酸溶解；對(duì)于酸性肽，建議用 10%NH4HCO3溶解。不溶于水的多肽也可以添 加有機(jī)溶劑助溶。用Z少量的有機(jī)溶劑（如 DMSO、DMF、異丙醇、甲醇等）將肽溶解，強(qiáng) 烈推薦先將肽溶于有機(jī)溶劑中，然后緩慢加入 水或其它緩沖液直至所需濃度。

Q：國肽生物能合成哪些修飾標(biāo)記的多肽？

A ：我公司提供多種修飾標(biāo)記的多肽，如乙?；?、生 物素標(biāo)記、磷酸化修飾、熒光修飾，也可以根據(jù) 您的特殊需要定制不同的修飾。

Q：哪種末端Z適合我的研究？

A：肽的末端默認(rèn)為N端游離的氨基，C端游離的 羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列， 為了與母本蛋白更為接近，肽末端往往需要封 閉，即N端乙酰化，C端酰胺化，這種修飾避免 引入多余電荷，也使其更能防止外切酶作用，使 肽更加穩(wěn)定。

Q：為什么要進(jìn)行N端乙?；珻端酰胺化修飾？

A：這些修飾可以使肽不會(huì)被降解掉，也可以使肽 模擬它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始狀態(tài)。

Q：就磷酸化肽的設(shè)計(jì)能不能給出一些建議？

A：隨著長度的增加，從磷酸化的那個(gè)氨基酸往后 偶聯(lián)效率逐漸降低。合成方向從C端到N端，建 議磷酸化的那個(gè)氨基酸以后的殘基不要超過10 個(gè)，也就是說從N端往C端數(shù)磷酸化氨基酸之 前的氨基酸殘基best不要超過10個(gè)。

Q：如果想在N端做生物素修飾，需要在生物素 和肽序列之間加一個(gè)間隔嗎？

A ：我公司采用的標(biāo)準(zhǔn)的生物素標(biāo)記程序是先往肽 鏈上連一個(gè)Ahx，然后再連生物素。Ahx是一個(gè) 6碳化合物，把它加在肽和生物素之間起到間隔 的作用。

Q：是不是在肽和修飾標(biāo)記的染料之間都需要加 一個(gè)間隔？

A：如果你打算將一個(gè)大分子（如某種染料）連到肽上，best在肽和配體之間設(shè)一個(gè)間隔，以盡量減 少肽本身的折疊作用或者其偶聯(lián)物的折疊作用對(duì)受體造成的干擾。也有人不希望間隔的存在，例 如，在蛋白質(zhì)的折疊研究中，可以通過確定將熒 光染料連在某個(gè)氨基酸的某個(gè)位點(diǎn)上來研究二者 在折疊結(jié)構(gòu)上相距多遠(yuǎn)。

Q：我需要合一條環(huán)肽，其中含有一個(gè)色氨酸， 它會(huì)被氧化嗎？

A：色氨酸的氧化是肽氧化中的常見現(xiàn)象，而肽一 般是先環(huán)化再純化，如果其中的色氨酸發(fā)生了 氧化作用，肽在HPLC柱上的滯留時(shí)間會(huì)發(fā)生變 化，氧化可以通過純化去除。再者，氧化的肽也 可以通過MS檢測到。

Q：如何確定肽已成環(huán)？

A ：我們用Ellman反應(yīng)來檢測成環(huán)反應(yīng)是否完全。 如果Ellman檢測結(jié)果為陽性（黃色），說明成環(huán) 反應(yīng)不完全；如果檢測結(jié)果為陰性（不是黃色）， 說明成環(huán)反應(yīng)已進(jìn)行完全。我們對(duì)客戶不提供 環(huán)化鑒定的分析報(bào)告，一般在QC報(bào)告單中會(huì)有 關(guān)于Ellman檢測結(jié)果的描述。

Q：含有Cys的多肽在出貨前經(jīng)過還原了嗎？

A ：如果沒有發(fā)現(xiàn)肽已經(jīng)被氧化，我們一般不對(duì)Cys 進(jìn)行還原。所有的多肽都是由粗品在pH2條件 下純化、凍干后得到的，這樣的pH條件至少在 某種程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般 在pH2條件下進(jìn)行純化，除非有特殊原因需要 在pH6.8條件下純化。如果純化在pH6.8進(jìn)行， 純化產(chǎn)物必須馬上用酸處理以防氧化。在Z后 的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，對(duì)于含有Cys的肽，如果MS 圖譜上發(fā)現(xiàn)有分子量為(2P+H)的物質(zhì)存在，說 明已形成二聚體。如果MS和HPLC都沒有問題， 我們就直接凍干后出貨，無須再做任何處理。需 要指明的是，含有Cys的肽隨著時(shí)間的推移會(huì)發(fā) 生緩慢的氧化，氧化程度主要取決于肽序列及 貯存條件。

國肽生物主要提供：多肽合成、多肽定制、同位素標(biāo)記肽、人工胰島素、磷酸肽、生物素標(biāo)記肽、熒光標(biāo)記肽（Cy3、Cy5、Fitc、AMC等）、目錄肽、偶聯(lián)蛋白（KLH、BSA、OVA等）、美容肽、化妝品肽、多肽文庫構(gòu)建、抗體服務(wù)、糖肽、訂書肽、藥物肽、RGD環(huán)肽等。

國肽生物：www.bankpeptide.com

銷售郵箱：sales@bankpeptide.com

電話：0551-62626599

地址：合肥市高新區(qū)香樟大道168號(hào)科技實(shí)業(yè)園C6#4層