摘要

殺菌劑百菌清（CHT）因其高效、殺菌等優(yōu)點在茶園中得到廣泛應(yīng)用。據(jù)報道，反復(fù)施用CHT會抑制土壤硝化過程。然而，CHT對土壤反硝化和相關(guān)N2O排放的急性影響尚不清楚。本研究評估了硝酸鹽（NO3?)72℃高溫處理后茶園土壤的去除、反硝化基因豐度和反硝化酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將CHT從5 mg kg增加到25 mg kg?1抑制NO3?去除效率從74.6%提高到54.1%，但N2O排放量從23.1%增加到94.8%。用25 mg kg治療后?在CHT中，nirK、nirS和nosZ基因的豐度分別降低了31.6%、22.1%和50.7%。另外，電子傳遞系統(tǒng)活性（ETSA）值和三磷酸腺苷（ATP）含量的下降表明CHT對微生物代謝有抑制作用。酶活性研究進(jìn)一步表明，硝酸還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）和一氧化氮還原酶（NOR）活性的降低是CHT抑制反硝化作用的主要原因。此外，反硝化還原酶活性與細(xì)胞內(nèi)代謝呈正相關(guān)，表明微生物代謝的減少也應(yīng)是CHT對反硝化過程的抑制作用的原因?？偟膩碚f，研究發(fā)現(xiàn)，土壤急性暴露于CHT可抑制反硝化過程并顯著增加N2O排放，這可能導(dǎo)致土壤氮循環(huán)破壞和全球變暖加劇。

1、引言

百菌清（CHT）由于其潛在的環(huán)境毒性，近幾十年來備受關(guān)注。CHT作為一種廣譜非系統(tǒng)殺菌劑，廣泛用于控制小麥、水稻、蔬菜、花生、茶葉等作物的病蟲害（張等，2014）。茶葉作為許多亞洲國家的重要經(jīng)濟(jì)作物，需要定期施用CHT來控制茶樹病害（Gilho等人，2000）。CHT能牢固粘附在茶樹表面，并能抵抗雨水和水的侵蝕。作為一種中等持久性農(nóng)藥，CHT在不同土壤中的半衰期（t1/2s）從三天到一個月不等（Hladik和Kuivila，2008；Singh等人，2002；Van Scoy和Tjeerdema，2014；Wu等人，2012）。由于其在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，在水、沉積物和土壤中發(fā)現(xiàn)了CHT及其代謝產(chǎn)物（Hladik和Kuivila，2008；Putnam等人，2003）。

氮循環(huán)是全球生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分，與富營養(yǎng)化、水體酸化和溫室效應(yīng)等一系列環(huán)境問題密切相關(guān)。作為氮循環(huán)的關(guān)鍵組成部分，反硝化可以減少硝酸鹽（NO3?)從陸地和水生環(huán)境到氮（N2）。特別是，脫氮過程中可能會產(chǎn)生一氧化二氮（N2O），這是因為其具有巨大的全球變暖潛力（比二氧化碳（CO2）高300倍）（IPCC，2006年）。先前的研究表明，CHT應(yīng)用抑制了土壤微生物活性（Sigler和Turco，2002），抑制了土壤硝化過程（Kinney等人，2005），并降低了土壤氮循環(huán)的功能基因豐度（Zhang等人，2016）。例如，Kinney等人（2005）進(jìn)行的一項研究表明，由于土壤硝化作用對CHT的高度敏感性，在土壤中添加CHT會減少N2O的產(chǎn)生。張等（2016）報道，重復(fù)施用CHT可能會對幾種氮循環(huán)基因的豐度產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響，例如amoA、amoB和nosZ基因。此外，CHT可以在不同類型的土壤中以較高的添加速率顯著抑制硝化作用（Lang和Cai，2009）。盡管之前的研究已經(jīng)表明CHT對硝化有負(fù)面影響，但CHT對反硝化的影響仍不確定。

脫氮需要從NO3開始一個連續(xù)的生物還原過程?至亞硝酸鹽（NO2?),一氧化氮（NO）、N2O和N2。為了完成這一過程，反硝化需要接受來自其他生物過程的電子，例如碳源代謝和電子傳輸系統(tǒng)（Zumft，1997）。電子由碳源代謝產(chǎn)生，并傳遞到電子傳輸系統(tǒng)。然后，它們將在反硝化還原過程中被消耗，該過程由硝酸還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）、一氧化氮還原酶（NOR）和氧化亞氮還原酶（NOS）催化（Saggar等人，2013）。除了電子外，碳源代謝和電子傳遞鏈也可以產(chǎn)生ATP。作為細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)移的貨幣單位，其水平與脫氮密切相關(guān)（Knowles，1980）。遺憾的是，目前尚不清楚反硝化的綜合分子機(jī)制，其涵蓋了廣泛的方法（即ETSA值、ATP含量和反硝化酶活性）。因此，土壤反硝化過程的全貌尚不清楚。

基于此，本研究旨在探討CHT施用對土壤反硝化的急性影響及其相關(guān)分子機(jī)制。作為試驗土壤，我們收集了中國江西省的茶園土壤。本研究的具體目標(biāo)是：（1）研究NO3?不同CHT暴露濃度下的減少和N2O排放；（2）研究CHT施用后的反硝化還原酶活性、反硝化基因豐度和微生物群落；（3）評估CHT對電子傳遞鏈和微生物活性的急性影響；（4）了解反硝化過程與分子生物學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系?？紤]到之前關(guān)于CHT應(yīng)用于土壤微生物活性的報道，我們假設(shè)：1）CHT應(yīng)用可以抑制土壤反硝化過程；2）CHT通過影響反硝化酶活性來抑制反硝化；3）CHT施用后其他微生物活性的相關(guān)變化會影響土壤反硝化過程；ETSA值和ATP含量與反硝化酶活性密切相關(guān)。

2、材料和方法

2.1樣品和化學(xué)品

2017年7月7日，從中國江西省江西紅壤研究所（28°15′N，116°55′E）采集了5公斤茶園土壤樣本（0-20厘米深）。土壤在室溫下風(fēng)干，通過2 mm篩網(wǎng)篩分以去除石塊和塑料碎屑，在室溫下儲存，然后在10小時內(nèi)進(jìn)行實驗。實驗前，部分樣品用于測定CHT殘留物和土壤理化性質(zhì)。所有樣本均未檢測到CHT或其代謝物的濃度。表S1顯示了采樣土壤的選定物理化學(xué)性質(zhì)。CHT（98%活性成分）購自中國阿拉丁科技公司。CHT標(biāo)準(zhǔn)溶液購自中國J＆K Scientific。

2.2土壤急性暴露于CHT

土壤樣本暴露于CHT濃度范圍內(nèi)（0、5、10和25 mg kg?1：分別為C0、C5、C10和C25），對應(yīng)于推薦劑量（5 mg kg）?1），2倍劑量（10 mg kg?1）和5倍劑量（25 mg kg?1）（Teng等人，2017年）。簡言之，將80 g干茶園土壤放置在血清瓶中，用含有相同濃度NO3的10 mL溶液處理每一種土壤?-N（110 mg kg?1）和葡萄糖（5 mg g?1).溶解CHT配方并添加到土壤樣品中，以達(dá)到5、10和25 mg kg的目標(biāo)濃度?1，并向一個瓶子中加入等量的蒸餾水作為對照。蒸餾水也被添加到每個瓶子中，以將最終土壤含水量保持在持水量的60%，這與土壤的原始狀態(tài)相似。為了維持厭氧條件，將氮?dú)庾⑷胝麴s水中（30分鐘，30–40毫升/分鐘），以保持其最終氧化還原電位（ORP）=?300 mV和溶解氧（DO）分別為0.1 mg/L。用橡膠塞密封后，將含有土壤的血清瓶在28±1°C的恒溫下培養(yǎng)72小時，以測定NO3?,NO2號?將相當(dāng)于2 g干土的銨（NH4+）與20 mL 2 M KCL混合，并在200 rpm下?lián)u晃30分鐘（Miller等人，2008）。離心土壤溶液（4000 rpm，10分鐘），并通過0.45μm孔徑過濾器過濾懸浮液。然后，使用離子色譜ICS-600（美國Thermo Fisher Scientific）分析濾液。為了測定最終的N2O濃度，在培養(yǎng)結(jié)束時，用氣密注射器抽取每個瓶子的10毫升頂空樣品。使用配備電子捕獲檢測器的氣相色譜法（2010 plus，日本島津）分析氣體樣本（劉等人，2018）。根據(jù)測定的NO3?,NO2號?,土壤提取物中的NH4+和N2O濃度，NO3?,NO2號?,NH4+和N2O濃度轉(zhuǎn)換為mg N kg?1土壤。如Chaves等人（2008）所述，使用氣相色譜-質(zhì)譜法（TQ8040，日本島津）測定CHT殘留物。支持信息中描述了細(xì)節(jié)提取和測量方法。

2.3反硝化酶活性的測定

本研究使用Zheng等人（2014b）報告的方法檢測了四種反硝化酶（NAR、NIR、NOR和NOS）的活性。簡言之，在72小時暴露后，使用磷酸鹽緩沖鹽緩沖液從5 g土壤樣品中提取反硝化酶，沖洗兩次，然后再懸浮在10 mL 0.1 M磷酸鹽緩沖鹽（PBS）溶液中，進(jìn)行超聲處理（4°C，200 W）和離心處理（16000 rpm，10分鐘，4°C）。然后，將2 mL酶提取物添加到4 mL混合物中，該混合物根據(jù)先前報告的方法進(jìn)行了修改（Zheng等人，2014b）。酶測定混合物（總體積4.0 mL）包括：100 mM PBS緩沖液、10 mM Na2S2O4和10 mM甲基紫精作為電子供體，以及2 mM電子受體（NO3）?和NO2?或NO和N2O）。培養(yǎng)30分鐘（保持在30°C）后，NO3?和NO2?通過分光光度法測量濃度（DR 5000，HACH，美國），并通過微傳感器（MMMMmeter，Unisense，Denmark）檢測液相中的N2O濃度（Zheng等人，2014a）。NAR和NIR活性計算為μmol NO2-N·g?1土壤·h?1，NOR和NOS活性計算為μmol N2O-N·g?1土壤·h?1.

2.4.ETSA和ATP的測定

在本研究中，通過將2-（新苯基）-3-（對硝基苯基）-5-苯基四氮唑氯化物（INT）還原為甲贊（INF）來測量土壤中細(xì)菌的ETSA值（Broberg，1985；Wan等人，2016）。簡而言之，在不同CHT濃度（C0、C5、C10和C25）下培養(yǎng)72小時后，在類似于酶提取過程的過程中收獲細(xì)菌。然后，向收獲的溶液中添加1 mL INT和1 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），并在黑暗中（30°C，30分鐘，200 rpm）培養(yǎng)。為了終止反應(yīng)，向混合物中添加1 mL甲醛。在4000 rpm下離心10分鐘后，使用5 mL薄荷醇從混合物（200 rpm，20分鐘）中提取INF，然后在10000 rpm下離心5分鐘。最后，在490 nm處用分光光度法檢測INF提取物，并根據(jù)吸光度（ABS）值計算ETSA，即μgO2·mg?1蛋白質(zhì)·min?1（Wan等人，2016年）。

用磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、三氯乙酸（TCA）和百草枯（TPP）提取5 g潮濕土壤樣品。提取后立即進(jìn)行超聲波處理（4°C，2分鐘，200 W）（Martens，2001）。在離心土壤樣品（4°C，20分鐘，13000 rpm）后，提取懸浮液并將其儲存在0°C的塑料瓶中，并使用ATP測試試劑盒（中國江蘇南京建誠科技有限公司）測量ATP濃度。ATP含量也根據(jù)ABS值計算為nmol g?1.

2.5 DNA提取和實時定量PCR分析

根據(jù)制造商的說明，使用土壤快速DNA?旋轉(zhuǎn)試劑盒從對照處理和C25 CHT改良處理的5 g土壤樣本中提取土壤DNA。使用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計（美國Thermo Scientifisher）測定最終DNA濃度和純化，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質(zhì)量。進(jìn)行實時定量PCR分析以評估細(xì)菌16S rRNA總量和反硝化過程中功能基因的豐度，包括硝酸鹽還原（narG）、亞硝酸鹽還原（nirK和nirS）、一氧化氮還原（norB）和氧化亞氮還原（nosZ）（表S2）（Saggar等人，2013）。所有樣品一式三份。功能基因的擴(kuò)增效率為85-109%，R2值為0.990-0.998。

2.6高通量16S rRNA基因測序和分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案對16S rRNA基因進(jìn)行高通量Illumina MiSeq測序（Caporaso等人，2012年）。原始fastq文件被解復(fù)用，通過Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量過濾，并通過短讀取（FLASH）軟件的快速長度調(diào)整進(jìn)行合并。通過核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）分類器算法對照16S rRNA數(shù)據(jù)庫分析每個16S rRNA基因序列的分類(http://rdp.cme.msu.edu/)使用80%的置信閾值。

2.7統(tǒng)計方法

所有實驗參數(shù)一式三份，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單向方差分析（ANOVA）和Tukey t檢驗比較C0、C5、C10和C25處理之間的差異。使用SPSS 19.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)在P b 0.05時被認(rèn)為存在顯著差異。

3、結(jié)果和討論

3.1 CHT在土壤中的殘留

如圖1所示，在72小時后測量不同改良處理中的CHT殘留濃度。CHT殘留濃度分別為3.8±3.3、7.7±1.8和22.8±1.4 mg kg?C5、C10和C25處理中分別為1。方差分析顯示，C25處理的CHT濃度在統(tǒng)計學(xué)上顯著高于C5（P b 0.01）和C10（P b 0.01）。C10處理的CHT濃度也顯著高于C5處理（P＜0.05）。本研究中測得的CHT濃度高于Souza等人（2017）報告的結(jié)果，這可能是由于初始土壤應(yīng)用中的濃度較高。或者，低耗散率也可能導(dǎo)致CHT累積。不同研究中CHT的土壤降解速率差異很大（Singh等人，2002年；Souza等人，2017年）。先前的研究表明，CHT降解與土壤條件密切相關(guān)（Van Scoy和Tjeerdema，2014），中性pH值和3-4%的總碳含量等土壤特性有利于CHT的高效降解（王等人，2011）。在本研究中，茶園土壤的低pH值可能是CHT在土壤中低效降解和高積累的原因。

圖1.三種濃度的百菌清（CHT）（5、10和25 mg kg）的殘留?1）施用后72小時在土壤中。誤差條表示三次測試的標(biāo)準(zhǔn)偏差。A*以上數(shù)據(jù)表明對照組和CHT處理之間存在顯著差異（P b 0.05）。

3.2 CHT對土壤反硝化過程的影響

為了比較對照處理和CHT應(yīng)用處理中的反硝化過程，研究了NO3的變化?和NO2?本研究確定了72小時試驗期間的濃度以及最終N2O濃度。

圖2百菌清（CHT）對NO3變化的影響?（a），最終編號2?反硝化過程中的濃度（b）和最終N2O生成（c）。誤差條表示三次測試的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Tukey t檢驗，與對照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

如圖2a所示，NO3的最終濃度?在測試的四種處理中，范圍為18.5至54.2 mg N kg?1、與C5、C10和C25處理相比，NO3的83.8%?在對照治療（C0）中被移除。3號?C25處理的去除率顯著下降至54.1%（P＜0.01）。NO2的變化?72小時內(nèi)的濃度如圖S1所示，最終NO2?四種處理的濃度不同（C25≈C10?C5 N C0），范圍為3.5 mg N kg?1（C0）至5.3 mg N kg?1（C25）。考慮到接觸CHT的潛在毒性，較高的NO2?C10（P b 0.01）和C25（P b 0.01）處理中的累積可能是由于CHT對NO3的負(fù)面影響?和NO2?還原過程。此前的一項研究也報告了不同殺菌劑（如2-氯-4-苯基苯酚和2-芐基-4-氯酚）對反硝化過程的類似抑制作用（Holzem等人，2014）。結(jié)果表明，隨著殺菌劑濃度的增加，反硝化抑制作用增強(qiáng)。然而，郎和蔡（2009）觀察到CHT和多菌靈對反硝化的不同現(xiàn)象。據(jù)報道，這兩種殺菌劑在田間添加速率下對反硝化沒有影響，而CHT在濃度為110或220 mg kg時對土壤反硝化略有抑制?1.殺菌劑對土壤反硝化作用的不同影響可能與殺菌劑類型、添加量、培養(yǎng)條件和土壤微生物群落有關(guān)。如圖2c所示，對照組中的最終N2O濃度（39μg N kg?1）顯著低于C25處理（76μg N kg）?1）（P b 0.01），比對照組高1倍。這一結(jié)果與之前的研究一致，之前的研究報告稱，施用殺菌劑后，N2O排放和積累增加（Yan等人，2015年）。在本研究中，實驗期間土壤NH4+濃度沒有明顯變化（圖S2），表明沒有發(fā)生實質(zhì)性的硝化作用，幾乎所有的N2O都是通過反硝化作用產(chǎn)生的。Kinney等人（2005）報告說，增加CHT施用量會抑制反硝化過程中的N2O生成。這表明CHT可能抑制NO到N2O的還原過程，并減少N2O的生成?；谶@些數(shù)據(jù)，本研究中C25處理的最終N2O濃度較高可能是由于對N2O消耗過程的抑制作用強(qiáng)于對N2O生產(chǎn)過程的抑制作用。對于N2O的排放，N2O消耗過程（N2O→N2）似乎比其生產(chǎn)過程更重要（否→N2O）（Van den Heuvel等人，2011年）。鑒于此，本研究測定了四種反硝化酶的活性，以評估CHT對反硝化過程每個步驟的影響。