3月20日， × 優(yōu)寧維標(biāo)簽蛋白純化第二講也圓滿落幕啦！
當(dāng)天，直播間互動(dòng)火爆，兩位純化專家手把手教大家拆解了 GST 標(biāo)簽純化全流程，全程還有精美好禮送不停！
親和層析原理深度解析
GST重組蛋白質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)優(yōu)化
層析柱選擇與洗脫條件優(yōu)化
經(jīng)典案例深度剖析常見問題
錯(cuò)過了這場(chǎng)直播？
不用擔(dān)心
精華筆記已整理完畢
Q1
原核表達(dá)用BL21菌株更合適？
BL21菌株是Lon和ompT蛋白酶缺陷型菌株。
Lon是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，ompT是一種外膜蛋白酶，它們的缺失可以有效減少目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解，從而提高GST標(biāo)簽蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。
Q2
蛋白表達(dá)如何優(yōu)化？
培養(yǎng)的溫度，增加通氣性和優(yōu)化誘導(dǎo)條件是最先考慮的改變項(xiàng)。
例如：原核表達(dá)體系可以對(duì)IPTG誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行摸索。
Q3
PreScission，Thrombin和Factor Xa幾種標(biāo)簽切割酶有什么區(qū)別？
1
這幾種內(nèi)切酶的識(shí)別序列不同；
2
PreScission可在4℃下酶切，且?guī)в蠫ST標(biāo)簽，可通過GST柱去除。Thrombin或Factor Xa更適合在室溫條件酶切，酶切后可用苯甲脒的柱子HiTrap Benzamidine FF去除多余的酶。
3
三種酶的酶切緩沖液不同
PreScission：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5 at 5°C for 16 h。
Thrombin：PBS at 22°C for 16 h。
Factor Xa：1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) at 22°C for 16 h。
4
在進(jìn)行GST標(biāo)簽酶切時(shí)，應(yīng)注意保證酶的用量和酶切時(shí)間，并且酶切應(yīng)在合適的溫度和酶切緩沖液中進(jìn)行。
Q4
GST標(biāo)簽純化有哪些小TIPS？
1
我們建議您在結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液中加入1-10 mM DTT，以防止GST氧化聚集和還原型谷胱甘肽被氧化。
2
此外，在純化時(shí)也要注意緩沖液的PH，結(jié)合緩沖液最適pH 6.5–8，洗脫緩沖液提高pH至8–9。
3
GST結(jié)合動(dòng)力學(xué)較慢，目標(biāo)蛋白結(jié)合較弱時(shí)可適當(dāng)降低上樣流速。
Q5
Glutathione Sepharose HP，F(xiàn)F，4B有什么區(qū)別，如何選擇？
這3款填料都是非常經(jīng)典的GST標(biāo)簽純化產(chǎn)品，三者的配基完全相同，但配基密度和填料骨架略有差異。其中4B這款產(chǎn)品的配基密度較高，載量也較高。具體參數(shù)見下圖：
Q6
GST填料如何進(jìn)行清洗？是否可以耐受氫氧化鈉？
GST填料不耐受氫氧化鈉，0.5 M氫氧化鈉處理填料可導(dǎo)致填料配基完全失活。
填料清潔可參考產(chǎn)品說明書：
去除蛋白類的殘留，推薦使用6 M鹽酸胍。
去除疏水類型的殘留，可使用70%乙醇或者1% Triton X-100。
想要解鎖更多標(biāo)簽蛋白純化秘籍？
3月27日 15:00
“大師課”收官直播——
MBP，Strep，Protein Select標(biāo)簽專場(chǎng)
即將開講
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