細胞凋亡（Apoptosis）是一種有序的或者程序性的細胞死亡方式，是細胞受到特定基因調(diào)控后的主動性死亡過程，也是正常的細胞生理應答反應，凋亡的細胞最終將被體內(nèi)吞噬細胞處理。過度的細胞凋亡將直接導致組織器官功能的下降；而對于癌細胞來說，凋亡過程中斷則意味著癌癥的發(fā)展和擴散。

細胞的形態(tài)學變化

通常可分為3個階段。第1階段是細胞的間接觸消失，但是胞膜尚完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體脫落，細胞核出現(xiàn)固縮表現(xiàn)，本階段持續(xù)時間很短；第2階段是細胞核碎裂后與細胞內(nèi)的各種細胞器結(jié)合，并進一步被質(zhì)膜包裹形成凋亡小體；第3階段是吞噬細胞吞噬凋亡小體，并將其消化為重新供機體使用。

 

細胞凋亡的機制

（1）細胞凋亡的死亡受體途徑及調(diào)控：死亡因子受體(Fas)/死亡因子Fas配體( FasL)死亡通路 ；TNFR 死亡通路。

（2）線粒體途徑及調(diào)控。

（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路：CHOP通路；JNK 通路；Caspases 12通路。

（4）端粒酶途徑的細胞凋亡。

（5）NO參與的細胞凋亡反應。

 

常用的細胞凋亡檢測方法有以下幾種：

①形態(tài)學檢測

發(fā)生凋亡的細胞在形態(tài)上有一定的特征，最常用的形態(tài)學檢測手段是熒光共聚焦激光掃描顯微鏡和透射電子顯微鏡，前者可讓特異性染料（Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI）染色，可非嵌入式結(jié)合A-T堿基區(qū)的DNA在受到紫外線激發(fā)時會發(fā)射明亮的藍色熒光。

DAPI染色，Hela細胞凋亡時核染色質(zhì)的形態(tài)學變化

 

同時，凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa 期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。電鏡下可看到凋亡細胞體積變小，表面微絨毛消失，細胞質(zhì)濃縮。

電鏡下，Jurkat細胞凋亡時核染色質(zhì)的形態(tài)變化
 

②用的最多的Annexin V /PI雙染色法檢測早期凋亡

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)位于細胞膜的內(nèi)表面，細胞凋亡時，細胞膜發(fā)生變化， PS從細胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細胞膜的外表面。Annexin V是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS, 而活細胞的PS位于細胞膜的內(nèi)表面，無法與Annexin V特異性結(jié)合。所以可以用FITC偶聯(lián)的Annexin V鑒別凋亡細胞和活細胞。

 

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細胞膜的外表面，Annexin V也能識別壞死細胞表面的PS, 所以Annexin V無法區(qū)分壞死細胞和凋亡細胞。而PI染料能夠與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細胞和活細胞。早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會發(fā)射紅熒光，被相應通道接收。所以Annexin V和PI同時使用，就可以區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。

③細胞凋亡---線粒體膜電位檢測

JC-1是親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。正常生理狀態(tài)下，線粒體負電性高，JC-1進入線粒體以多聚體存在，紅色熒光強，細胞凋亡時，線粒體去極化產(chǎn)生，負電性降低，JC-1則以單體存在細胞質(zhì)，綠色熒光增強。

 

④細胞凋亡—活化的Caspase-3檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32 KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個大亞基（17 KD）和兩個小亞基（12 KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，Caspase-3 的活性明顯下降。

活化的Caspase-3由其前體裂解的一個17KD亞單位和一個12KD亞單位組成，形成異二聚體，可被Anti-Active Caspase-3抗體特異性識別。用熒光素標記Anti-Active Caspase-3抗體即可檢測到活化的Caspase-3。

 

⑤細胞凋亡—DNA片段化的檢測

細胞凋亡時染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180~200bp及其整數(shù)倍的寡核苷酸片段,。DNA一旦發(fā)生片段化，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)上會出現(xiàn)很多缺口，可以使用FITC標記的DUTP或BrdU在酶的作用下?lián)饺氲饺笨谥?，然后檢測摻入的信號強度，來判斷發(fā)生片段化的程度

 

⑥Tunel檢測法

此外，圍繞DNA斷裂的檢測方法還有Tunel檢測法。細胞凋亡時DNA雙鏈或單鏈斷裂會產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端。以此為線索，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）協(xié)助下，他成功將生物素/熒光素標記的dUTP綁定在3’-OH末端，并通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測來定量分析結(jié)果。

 

總之，細胞凋亡就是凋亡通路中的各種分子促成的，不能因為檢測單一指標就輕易斷定凋亡的發(fā)生。畢竟，細胞凋亡事件中，每個指證只維持一段時間，因而各位小伙伴們應該廣撒網(wǎng)、多撈魚，最好能在不同時間段進行多指標的同時檢測，這才能確定凋亡的發(fā)生。最后為了不造成假陽性和假陰性，陽性＆陰性對照也是必不可少的，以保證檢測結(jié)果的準確性。

 

YEASEN細胞凋亡檢測系列產(chǎn)品

產(chǎn)品	貨號	規(guī)格	價格（元）	促銷價（元）
Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit 細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒	40301ES50/60	50 T/100 T	298.00/528.00	283.00/502.00
Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	40302ES20/50/60	20 T/50T/100T	480.00/960.00/1680.00	366.00/686.00/986.00
Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit	40303ES20/50/60	20 T/50/100T	480.00/960.00/1680.00	386.00/786.00/1346.00
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit	40304ES20/50/60	20 T/50T/100T	518.00/1120.00/1960.00	386.00/786.00/1346.00
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit	40305ES20/50/60	20 T/50T/100T	518.00/1120.00/1960.00	386.00/786.00/1346.00
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）	40306ES20/50/60	20 T/50T/100T	1178.00/2680.00/4080.00	1119.00/2546.00/3672.00
TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 488）	40307ES20/50/60	20 T/50T/100T	1250.00/3080.00/4800.00	1188.00/2926.00/4320.00
TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 640) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 640）	40308ES20/50/60	20 T/50T/100T	1250.00/3080.00/4800.00	1188.00/2926.00/4320.00
Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit	40310ES20/50/60	20 T/50T/100T	480.00/960.00/1680.00	386.00/786.00/1346.00