2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因編輯療法產(chǎn)品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）獲英國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)MHRA有條件批準(zhǔn)上市，用于治療治療鐮狀細(xì)胞病（SCD）和輸血依賴性β-地中海貧血（TDT），是全球首款獲批上市的CRISPR基因編輯藥物。

圖1. CASGEVY™治療流程（Source：CRISPR Therapeutics官網(wǎng)）

CASGEVY™療法是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的治療方案，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因?yàn)槠浜唵涡院鸵子赗NA編程的潛力，是所有CRISPR-Cas系統(tǒng)中用于基因工程開發(fā)的最佳候選系統(tǒng)。目前基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于治療、育種、合成生物學(xué)等各個領(lǐng)域。

CRISPR基因編輯技術(shù)，除了眾所周知的CRISPR/Cas9體系外，CRISPR/Cas12a體系正憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢逐漸嶄露頭角。與CRISPR/Cas9體系相比，CRISPR/Cas12a體系在核酸酶結(jié)構(gòu)域、向?qū)NA（gRNA）以及產(chǎn)生的DNA末端類型等方面都有著顯著的差異，詳見下表：

圖2. Cas9系統(tǒng)與Cas12系統(tǒng)對比^[1]

除以上差異外，Cas12a在切割活性方面也與Cas9存在顯著區(qū)別。Cas9僅具有順式切割活性，用于DNA雙鏈斷裂。而Cas12a不僅具有順式切割活性，還具備獨(dú)特的反式切割活性，這使得它在基因編輯領(lǐng)域展現(xiàn)出更為廣泛的應(yīng)用潛力。

圖3. Cas12a順式及反式切割活性^[2]

基于CRISPR/Cas12a廣泛的應(yīng)用場景，翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點(diǎn)擊了解更多）酶改造及發(fā)酵純化工藝平臺新開發(fā)了來源于細(xì)菌Agathobacter rectalis的ArCas12a，與其它Cas12a（LbCas12a/AsCas12a）相比，其具有更高的溫度適應(yīng)性（25-55℃），非常適用于基因組編輯及核酸檢測等應(yīng)用場景。

以dsDNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補(bǔ)的spacer區(qū)）進(jìn)行體外切割，瓊脂糖凝膠電泳檢測切割效果。結(jié)果顯示翌圣的ArCas12a在crRNA的引導(dǎo)下可高效的切割dsDNA（600 bp）產(chǎn)生兩段切割產(chǎn)物（200 bp+400 bp）。

圖4. ArCas12a順式切割活性檢測 M：Marker；C：模板dsDNA

以dsDNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補(bǔ)的spacer區(qū)）及單鏈DNA報(bào)告探針（含有熒光報(bào)告集團(tuán)）進(jìn)行體外切割，當(dāng)ArCas12a與crRNA及靶標(biāo)DNA形成復(fù)合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報(bào)告探針，從而發(fā)出熒光。結(jié)果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復(fù)合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

圖5. ArCas12a反式切割活性檢測

將底物DNA與10 pmol ArCas12a共同孵育，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示翌圣的ArCas12a無核酸外切酶殘留。

圖6. ArCas12a核酸外切酶殘留檢測 C：陰性對照

將底物RNA與5 pmol ArCas12a共同孵育，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示翌圣的ArCas12a無RNase殘留。

圖7. ArCas12a RNase酶殘留檢測 C：陰性對照