每次復(fù)蘇細胞都手忙腳亂？好不容易復(fù)蘇的細胞竟然污染了？

今天教你如何有條不紊地GX復(fù)蘇細胞！

細胞復(fù)蘇流程

1、從液氮罐中取出凍存細胞，放入37℃水浴鍋中融化，輕柔離心后收集細胞沉淀；

2、緩慢用移液槍吸去上清，加入適量濃度和體積的完全培養(yǎng)基，重懸細胞沉淀，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)瓶；

3、根據(jù)細胞培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶的體積，補足完全培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

操作中的注意事項

（一）、小心取出凍存管

許多小型液氮罐的設(shè)計是將細胞凍存在帶蓋的提籃中，提籃會浸沒在液氮中。由于提籃中沒有孔格的劃分，細胞凍存管無法擺放整齊。取用細胞時候，實驗人員經(jīng)常需要逐一查看，尋找計劃復(fù)蘇的細胞。此過程耗時過久，可能會導(dǎo)致其他凍存管內(nèi)的細胞受損。

一般大型液氮罐會配置成列的凍存架和細胞存儲盒，取出凍存架和放回都需要平穩(wěn)小心處理，避免帶出大量液氮。罐內(nèi)液氮較多時，可適當(dāng)在罐口附近停留，等大部分液氮回流后再拎出。

注意

l  液氮在室溫下會快速氣化吸熱，濺到皮膚或者眼睛上會燙傷。從液氮罐中取細胞時，需要做好防護工作——戴好厚手套和護目鏡。

l  不要將凍存管丟入液氮罐，以防液氮濺出。

（二）、快速融化待復(fù)蘇細胞

當(dāng)找到準(zhǔn)備復(fù)蘇的凍存管后，不要著急放入水浴鍋，先檢查封口膜是否完整，如果貼了醫(yī)用膠布，膠布是否有破損？因為一旦凍存管中有液氮流入，直接放入水浴鍋中，管內(nèi)壓力驟升，可能導(dǎo)致凍存管炸裂，危及實驗人員。

復(fù)蘇細胞的核心技術(shù)，簡而言之就是快融。從液氮罐中取出的細胞，需及時放入37℃水浴鍋，進行快速融化，期間需不停地輕柔搖晃凍存管。在兩分鐘內(nèi)完全融化細胞。出于衛(wèi)生考慮，有些細胞房沒有水浴鍋，所以很多復(fù)蘇操作，需要在不同實驗室進行。如果兩個實驗室距離較遠，且實驗室室溫較高，可提前準(zhǔn)備一只干凈的燒杯，裝入37℃的水作中間緩沖。

注意

·        融化中不要讓水浴鍋中的水，流入凍存管中造成污染。

·        復(fù)蘇過程中要格外注重?zé)o菌操作，經(jīng)水浴鍋融化后，需對凍存管消毒。同時更換手套和口罩，全程避免移液器接觸管口及管壁?？梢?b>將凍存管放入無菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。

（三）、輕柔收集已復(fù)蘇細胞

收集細胞前，要將所用培養(yǎng)基提前配制預(yù)熱并擺放整齊，避免現(xiàn)用現(xiàn)配耽誤復(fù)蘇進程，讓剛復(fù)蘇的細胞及時接觸正常的生長環(huán)境。若凍存液中存在DMSO，請根據(jù)所用細胞對其敏感的程度，判斷要不要離心棄除。

剛復(fù)蘇的細胞狀態(tài)比較脆弱，應(yīng)避免多次吹打和離心。比如原代細胞在復(fù)蘇融化后，盡量不要進行離心操作，直接補足培養(yǎng)基，使細胞分散均勻，等3-6小時，細胞貼壁后，進行換液處理。此方式也適用于其他凍存狀態(tài)一般的細胞。

（四）、培養(yǎng)前，計數(shù)&活力檢測

復(fù)蘇過程中，細胞計數(shù)必不可少。原則上，凍存前和復(fù)蘇后，都需要對細胞進行計數(shù)和活率分析，判別凍存的效果和細胞復(fù)蘇后的狀態(tài)。

2018年9月，美國藥典（USP-NF）出臺了關(guān)于細胞凍存相關(guān)政策并明確指出，臺盼藍不能很好地識別剛復(fù)蘇的細胞（細胞的種類和臺盼藍的濃度不同，對染色結(jié)果都有較大的影響），建議使用兩種以上的方法進行細胞計數(shù)，如結(jié)合熒光染色計數(shù)法。

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內(nèi)置雙通道熒光柱（紅綠，紅藍，綠藍），可疊加兩種熒光結(jié)果，完成復(fù)雜的細胞樣品分析，AO/PI染色，一鍵計數(shù)便知結(jié)果。讓操作更簡易，計數(shù)更JZ圖片