自然界中的植物都會面臨各種病害的侵染。病害FZ更是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重中之重?？茖W(xué)家們一直致力于用各種技術(shù)研究植物病害的發(fā)病機制和FZ方法。在近年的ZX研究中，新興的組學(xué)研究技術(shù)逐漸成為病害研究的熱點。在各種組學(xué)技術(shù)中，從直觀、無損、快速、簡便以及農(nóng)業(yè)應(yīng)用推廣上考慮，植物表型成像分析技術(shù)無疑是ZY的選擇之一。

PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)及表型成像圖

傳統(tǒng)表型概念里以形態(tài)學(xué)指標(biāo)為主。而現(xiàn)代植物表型成像分析技術(shù)已經(jīng)不局限于形態(tài)學(xué)，其主要應(yīng)用的成像技術(shù)如下，它們在植物病害研究分別反映植物的不同表型變化與生理過程：

植物病害的病原體有病毒、細(xì)菌、真菌。而植物種類又有模式植物、谷物、蔬菜、水果等。植物表型成像分析技術(shù)能夠應(yīng)對這些不同的研究需求嗎？我們從具體的文獻案例里查找答案，本期主要介紹關(guān)于抗病毒基因、蔬菜水果的葉片細(xì)菌病害相關(guān)研究案例：

一、利用模式植物研究抗病毒基因

法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（INRA）的Jean-Luc Gallois研究團隊一直致力于馬鈴薯y病毒組的抗病基因研究。這一病毒組中包括蕪菁花葉病毒(TuMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、三葉草黃脈病毒(ClYVV)等重要的農(nóng)作物病毒。這方面研究的難點在于如何直觀、定量地測量病毒在植物樣品上的分布與積累。FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題。FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)僅能進行了葉綠素?zé)晒獬上駵y量，也提供了關(guān)鍵的GFP標(biāo)記病毒活體成像圖。GFP成像圖直觀地表現(xiàn)病毒量的差異，反映了不同基因功能對擬南芥病毒抗性的影響。同時，葉綠素?zé)晒獬上駝t反映病毒對光合系統(tǒng)的損傷，可以同步提供病害光合表型信息。

法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院利用FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)，從2015年起發(fā)表了一系列相關(guān)文章，研究方向包括病毒的TOR信號調(diào)控、跨物種合成eIF4E1等位基因獲得病毒抗性、利用CRISPR-Cas9 base editing基因編輯技術(shù)模仿eIF4E自然多態(tài)性與病毒抗性的關(guān)系、擬南芥敲除eIF4E1獲得ClYVV抗性但又與TuMV的敏感性相關(guān)等。

雖然GFP活體成像技術(shù)一般不歸于植物表型成像技術(shù)中，但在病害研究中會經(jīng)常利用帶GFP標(biāo)記的病原體來定量分析感染面積與病毒積累量。FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)的GFP活體成像功能也廣泛應(yīng)用與其他病原體的指示測量。

左圖：GFP標(biāo)記的丁香假單胞桿菌感染軟棗獼猴桃枝條（EcoTech生態(tài)實驗室提供）；右圖：堿性金屬蛋白酶對GFP標(biāo)記的TMV處理效果（Qin，2019）

參考文獻：

1. Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347

2. Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750

3. Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13

4. Qin Y, et al. 2019. Purification and Characterization of a Secretory Alkaline Metalloprotease with Highly Potent Antiviral Activity from Serratia marcescens Strain S3. Journal of Agricultural and Food Chemistry 67(11): 3168-3178

二、病害快速無損檢測與抗性品種鑒定

對植物病害進行快速檢測與早期預(yù)警，無損快速的植物表型成像技術(shù)無疑是不二之選。但植物表型組的相關(guān)參數(shù)少有幾十項，哪一項才是靈敏和準(zhǔn)確的呢？很多科學(xué)家都進行了相關(guān)的探索。

德國萊布尼茨蔬菜和觀賞植物研究所IGZ將剛發(fā)芽的生菜幼苗感染了立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），之后使用多種表型成像分析技術(shù)測試了各種不同參數(shù)，試圖確定哪些技術(shù)的哪個參數(shù)能夠更靈敏地將感染病害的植株和未感染的植株區(qū)分開。

研究中進行成像分析的參數(shù)與所屬技術(shù)如下：

l 葉綠素?zé)晒獬上瘢?/span>Fo、Fp、Ft、Fv、ZD光化學(xué)效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd、光合有效葉面積日相對生長速率A_abs和A_rel

l UV-MCF多光譜熒光成像：F440、F520、F690、F740及各個參數(shù)之間的比值

l 紅外熱成像：作物水脅迫指數(shù)I1、I2、I3、平均溫度、中值溫度、溫度范圍

l 反射光譜成像：R_NIR、R_RED、歸一化植被指數(shù)NDVI

成像技術(shù)的另一個優(yōu)勢就是可以同時測量幾十株乃上百株幼苗樣品，通過配套軟件就能夠簡便地去除圖像中的背景，自動計算相應(yīng)的參數(shù)。

更為方便的是，一臺加裝紅外熱成像模塊的FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)就可以完成所有上述參數(shù)的測量與成像。

左圖：FluorCam及ZX型FluorCam-Pro多光譜熒光成像系統(tǒng)；中圖：反射光譜歸一化植被指數(shù)NDVI成像圖的背景分割；右圖：基于RGB真彩成像對熱成像圖進行背景分割

測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染病害的植株和未感染的植株之間，ZD光化學(xué)效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd、歸一化植被指數(shù)NDVI、作物水脅迫指數(shù)I1、光合有效葉面積日相對生長速率A_rel、多光譜熒光F440、F520等參數(shù)都表現(xiàn)出顯著差異。通過進一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析ZZ發(fā)現(xiàn)ZD光化學(xué)效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd在本次實驗中的識別效果，誤差≤0.052。Fv/Fm＞0.73的生菜幼苗即可認(rèn)為是健康的。Fv/Fm甚能夠在病害癥狀發(fā)生前即可檢測到病菌感染。研究者希望通過進一步工作，將這一發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于園藝和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐，比如優(yōu)良抗病蔬菜品種的選育、病害的早期發(fā)現(xiàn)與FZ等。

熒光衰減比率Rfd和ZD光化學(xué)效率Fv/Fm的邏輯回歸函數(shù)，概率1代表健康植株，概率0代表染病植株

浙江大學(xué)同時使用FluorCam熒光成像系統(tǒng)對柑橘黃龍病進行了檢測分析。研究者通過對健康葉片、感染黃龍病葉片和養(yǎng)分缺乏葉片進行葉綠素?zé)晒獬上穹治觯_定了黃龍病的熒光標(biāo)志，即“光合指紋”，結(jié)合葉綠素?zé)晒鈪?shù)與成像圖，對葉片黃龍病取得了ZJ識別分類效果，準(zhǔn)確率達到97%。

左：不同特征選擇法獲得的葉綠素?zé)晒獬上駡D；右：實際測量中的FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)與柑橘葉片樣品

參考文獻：

1. Sandmann M, et al. 2018. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease 102: 1101-1107

2. Weng H, et al. 2020. Characterization and detection of leaf photosynthetic response to citrus Huanglongbing from cool to hot seasons in two orchards. Transactions of the ASABE 63(2): 501-512

北京易科泰生態(tài)技術(shù)公司提供植物病害表型全面技術(shù)方案：

l FluorCam葉綠素?zé)晒?/span>/多光譜熒光技術(shù)

l PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺

l FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x、SpectraPen手持式植物高光譜儀

l PhenoPlot?輕便型植物表型成像分析系統(tǒng)

l PhenoPlot?懸浮雙軌式表型成像分析系統(tǒng)

l PhenoTron?-HSI多功能高光譜成像分析系統(tǒng)

l PhenoTron?復(fù)式智能LED光源培養(yǎng)與光譜成像分析平臺

l PhenoTron?PTS植物光譜成像分析平臺

l PhenoTron?-XYZ表型成像分析系統(tǒng)