純相位空間光調(diào)制器在PSF工程中的應(yīng)用

一、引言

2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉，美國(guó)及德國(guó)三位科學(xué)家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner獲獎(jiǎng)。獲獎(jiǎng)理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”，從此人們對(duì)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) (PSF) 工程的認(rèn)識(shí)有了顯著提高。

Moerner 展示了 PSF 工程與 Meadowlark Optics SLM 的使用案例，用于熒光發(fā)射器的超分辨率成像和 3D 定位。 PSF工程已被證明使顯微鏡能夠使用多種成像模式對(duì)樣本進(jìn)行成像，同時(shí)以非機(jī)械方式在模式之間變化。這允許對(duì)具有弱折射率的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，以及對(duì)相位結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量測(cè)量。 已證明的成像方式包括：螺旋相位成像、暗場(chǎng)成像、相位對(duì)比成像、微分干涉對(duì)比成像和擴(kuò)展景深成像。

美國(guó)Meadowlark Optics 公司專注于模擬尋址純相位空間光調(diào)制器的設(shè) 計(jì)、開發(fā)和制造，有40多年的歷史，該公司空間光調(diào)制器產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于自適應(yīng)光學(xué)，散射或渾濁介質(zhì)中的成像，雙光子/三光子顯微成像，光遺傳學(xué)，全息光鑷(HOT)，脈沖整形，光學(xué)加密，量子計(jì)算，光通信，湍流模擬等領(lǐng)域。其高分辨率、高刷新率、高填充因子的特點(diǎn)適用于PSF工程應(yīng)用中。

圖1. Meadowlark 2022年新推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM

二、空間光調(diào)制器在PSF工程中的技術(shù)介紹

在單分子定位顯微鏡（SMLM）中，通過(guò)從相機(jī)視場(chǎng)中稀疏分布的發(fā)射點(diǎn)來(lái)估計(jì)單個(gè)分子的位置，從而克服了分辨率的衍射限制。可實(shí)現(xiàn)的分辨率受到定位精度和熒光標(biāo)簽密度的限制，在實(shí)踐中可能是幾十納米的數(shù)量級(jí)。有科研團(tuán)隊(duì)已經(jīng)將這種技術(shù)擴(kuò)展到三維定位。通過(guò)在光路中加入一個(gè)圓柱形透鏡或使用雙平面或多焦點(diǎn)成像，可以估算出分子的軸向位置。光斑的拉長(zhǎng)（散光）或光斑大小的差異（雙平面成像）對(duì)軸向位置進(jìn)行編碼。將空間光調(diào)制器（SLM）與4F中繼系統(tǒng)結(jié)合到成像光路中，可以設(shè)計(jì)更廣泛的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），為優(yōu)化顯微鏡的定位性能提供了可能。

利用空間光調(diào)制器（SLM）對(duì)熒光顯微鏡進(jìn)行校準(zhǔn)，可以建立一個(gè)遠(yuǎn)低于衍射極限的波前誤差，SIEMONS團(tuán)隊(duì)就利用Meadowlark空間光調(diào)制器實(shí)現(xiàn)了高精度的波前控制。原理證明和實(shí)驗(yàn)顯示，在1微米的軸向范圍內(nèi)，在x、y和λ的精度低于10納米，在z的精度低于20納米。對(duì)這篇文獻(xiàn)感興趣的話可以聯(lián)系我們查閱文獻(xiàn)原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》

下面我們來(lái)具體看看是如何應(yīng)用的，以及應(yīng)用效果如何。

圖2. A）SLM校準(zhǔn)分支和通過(guò)光路的偏振傳輸示意圖。額外的線性偏振濾波器沒有被畫出來(lái)，因?yàn)樗鼈兣c偏振分光器對(duì)齊。B）相機(jī)上的強(qiáng)度響應(yīng)作為λ/2-板不同方向α的SLM的相位延遲的函數(shù)。C) 光學(xué)裝置的示意圖。一個(gè)帶有SLM的中繼系統(tǒng)被添加到顯微鏡的發(fā)射路徑中（紅色），一個(gè)單獨(dú)的SLM校準(zhǔn)路徑（綠色）被納入發(fā)射中繼系統(tǒng)中。這允許在實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行SLM校準(zhǔn)。BE：擴(kuò)束器，DM：分色鏡，L：鏡頭，LPF：線性偏振濾鏡，M：鏡子。OL：物鏡，PBS：偏振分光鏡，TL：管鏡。

光路如上圖2所示，包括一臺(tái)尼康Ti-E顯微鏡，帶有TIRF APO物鏡（NA = 1.49，M = 100），一個(gè)200毫米的管狀鏡頭，一個(gè)帶有SLM的中繼系統(tǒng)被建立在顯微鏡的一個(gè)出口端口。中繼系統(tǒng)包括兩個(gè)消色差透鏡，一個(gè)向列型液晶空間光調(diào)制器（LCOS）SLM（Meadowlark，XY系列，512x512像素，像素大小=15微米，設(shè)計(jì)波長(zhǎng)=532納米）和一個(gè)偏振分光器，用于過(guò)濾未被SLM調(diào)制的X偏振光。第一個(gè)消色差透鏡在SLM上轉(zhuǎn)發(fā)光束。

第二個(gè)中繼鏡頭確保在EMCCD上對(duì)熒光物體進(jìn)行奈奎斯特采樣。顯微鏡配備了一套波長(zhǎng)為405nm、488nm、561nm和642nm的合束激光器。

   這個(gè)配置增加了一個(gè)用于校準(zhǔn)SLM的第二個(gè)光路。這個(gè)空降光調(diào)制器校準(zhǔn)光路是為測(cè)量入射到SLM上的X和Y偏振光之間的延遲差而設(shè)計(jì)的，為了測(cè)量某個(gè)SLM像素的調(diào)制，需要將SLM映射到校準(zhǔn)路徑的相機(jī)上。這種映射是通過(guò)在SLM上施加一個(gè)電壓增加的棋盤圖案來(lái)獲得的。平均捕獲的圖像和沒有施加電壓時(shí)的圖像之間的差異被用作角落檢測(cè)算法（來(lái)自Matlab - Mathworks的findcheckerboard）的輸入，以找到角落點(diǎn)。對(duì)這些點(diǎn)進(jìn)行仿生變換，并用于找到對(duì)應(yīng)于每個(gè)SLM像素的CMOS像素。

圖3. SLM校準(zhǔn)程序。A) 單個(gè)SLM像素的測(cè)量強(qiáng)度響應(yīng)作為應(yīng)用電壓的函數(shù)。每一個(gè)極值都對(duì)應(yīng)于等于π的整數(shù)倍的相位變化，并擬合一個(gè)二階多項(xiàng)式以提高尋找極值的精度。強(qiáng)度被分割成四個(gè)部分，它們被縮放為[0 1]。這個(gè)歸一化的強(qiáng)度（B）被轉(zhuǎn)換為相位（C），并反轉(zhuǎn)以創(chuàng)建該特定電壓段和像素的LUT（D）。E）20個(gè)隨機(jī)選擇的SLM像素的歸一化強(qiáng)度響應(yīng)，顯示像素間的變化。F) 測(cè)量的波前均方根誤差是校準(zhǔn)后立即使用校準(zhǔn)LUT的相位的函數(shù)，45分鐘后，以及制造商提供的LUT。G) 在不同的恒定相位下，用于成像光路的SLM部分的LUTs。暗點(diǎn)表示沒有3個(gè)蕞大值的像素。H) 測(cè)量的平均相位和預(yù)定相位之間的差異作為預(yù)定相位的函數(shù)。

    圖3解釋了SLM像素的校準(zhǔn)程序。首先，以256步測(cè)量作為應(yīng)用電壓函數(shù)的強(qiáng)度響應(yīng)，產(chǎn)生一連串的蕞小值和蕞大值，它們對(duì)應(yīng)于π或2π的遲滯。在被照亮的SLM平面內(nèi)的所有像素似乎有三個(gè)蕞大值，這意味著總的相位調(diào)制為4π或1094納米。這些極值出現(xiàn)的電壓是通過(guò)對(duì)極值附近的三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合拋物線來(lái)找到的，這增加了精度，并充分利用了SLM的16位控制。然后，強(qiáng)度被分為四段，用公式（11）的逆值對(duì)這些段進(jìn)行縮放并轉(zhuǎn)換為相位。相位響應(yīng)被用來(lái)為每個(gè)SLM像素構(gòu)建一個(gè)單獨(dú)的查找表（LUT），以補(bǔ)償SLM的非均勻性。LUT參數(shù)在SLM上平滑變化，并與肉眼可見的法布里-珀羅條紋大致對(duì)應(yīng)，表明相位響應(yīng)的差異是由于液晶層厚度的變化造成的。額外的像素與像素之間的變化可能來(lái)自底層硅開關(guān)電路的像素與像素之間的變化。完整的校準(zhǔn)需要大約5分鐘（在四核3.3GHz i7處理器上的3分鐘掃描和2分鐘計(jì)算時(shí)間），但原則上可以優(yōu)化到運(yùn)行更快。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖4 測(cè)量的PSF與矢量PSF模型擬合之間的PSF比較。G-I）平均測(cè)量的PSF是由大約108個(gè)光子攜帶的信號(hào)通過(guò)上采樣（3×）和覆蓋所有獲得的斑點(diǎn)編制而成。比例尺表示1μm。

    圖4顯示PSF模型的預(yù)測(cè)結(jié)果。通過(guò)這種方式，實(shí)驗(yàn)的PSF是由～108個(gè)光子的累積信號(hào)建立起來(lái)的。實(shí)驗(yàn)和理論上的矢量PSF之間的一致性通常是非常好的，甚至在蕞大的離焦值的邊緣結(jié)構(gòu)也是非常匹配的。剩下的差異，主要是光斑的輕微變寬，是由于入射到相機(jī)上的光的非零光譜寬度，由于發(fā)射光譜的寬度和四帶分色器的帶通區(qū)域的寬度。邊緣結(jié)構(gòu)中也有一個(gè)小的不對(duì)稱性，這可能是由光學(xué)系統(tǒng)中殘留的高階球差造成的。

    所有工程PSF的一個(gè)共同特點(diǎn)是，與簡(jiǎn)單的二維聚焦斑點(diǎn)相比，它們的復(fù)雜性必須在PSF模型中得到體現(xiàn)，該模型被用于估計(jì)三維位置（可能還有發(fā)射顏色或分子方向）的參數(shù)擬合算法。簡(jiǎn)化的PSF模型，如高斯模型、基于標(biāo)量衍射的Airy模型、Gibson-Lanni模型，或基于Hermite函數(shù)的有效模型都不能滿足這一要求。一個(gè)解決方案是使用實(shí)驗(yàn)參考PSF，或用花樣擬合這樣的PSF作為模型PSF，或者使用一個(gè)或多個(gè)查找表（LUTs）來(lái)估計(jì)Z-位置。矢量PSF模型也可以用于復(fù)雜的3D和3D+λ工程PSF。眾所周知，矢量PSF模型是高NA熒光成像系統(tǒng)中圖像形成的物理正確模型。復(fù)雜的工程PSF的另一個(gè)共同特點(diǎn)是對(duì)擾亂設(shè)計(jì)的PSF形狀的像差的敏感性，并以這種方式對(duì)精度和準(zhǔn)確性產(chǎn)生負(fù)面影響。為了實(shí)現(xiàn)精確到Cramér-Rao下限（CRLB），即無(wú)偏估計(jì)器的蕞佳精度，光學(xué)系統(tǒng)的像差水平應(yīng)該被控制在衍射極限（0.072λ均方根波前像差），這個(gè)條件在實(shí)踐中往往無(wú)法滿足。因此，需要使用可變形鏡或?yàn)楫a(chǎn)生工程PSF而存在的SLM對(duì)像差進(jìn)行校正。自適應(yīng)光學(xué)元件的控制參數(shù)可以使用基于圖像的指標(biāo)或通過(guò)測(cè)量待校正的像差來(lái)設(shè)置。后者可以通過(guò)基于引入相位多樣性的相位檢索算法來(lái)完成，通常采用通焦珠掃描的形式。這已經(jīng)在高數(shù)值孔徑顯微鏡系統(tǒng)、定位顯微鏡中實(shí)現(xiàn)，并用于提高STED激光聚焦的質(zhì)量。

三、PSF應(yīng)用對(duì)液晶空間光調(diào)制器的要求

1.光利用率

    對(duì)于這個(gè)應(yīng)用來(lái)說(shuō)，SLM將光學(xué)損失降到蕞低是很重要的。PSF工程使用SLM來(lái)操縱顯微鏡發(fā)射路徑上的波前。在不增加損失的情況下，熒光成像中缺乏信號(hào)。使用具有高填充系數(shù)的SLM可以蕞大限度地減少衍射的損失。

     Meadowlark公司能提供標(biāo)速版95.6%的空間光調(diào)制器，分辨率達(dá)1920x1200，高刷新率版像素1024x1024，填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到100%，一級(jí)衍射效率可以做到98%。高分辨率能在滿足創(chuàng)建復(fù)雜相位函數(shù)的同時(shí)，能夠提升系統(tǒng)的光利用率。

2.刷新率（蕞高可達(dá)1K Hz）

高速度可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)的深層組織超分辨率成像?？梢姽獠ǘ无└呖蛇_(dá)1K Hz刷新速度（@532nm）。

3.分辨率（1920x1200）

    高分辨率的SLM是創(chuàng)建三維定位所需的復(fù)雜相位函數(shù)的理想選擇，如此能夠?qū)γ總€(gè)小像元區(qū)域的光場(chǎng)進(jìn)行自由調(diào)控。

    上海昊量光電作為Medowlark在中國(guó)大陸地區(qū)總代理商，為您提供專業(yè)的選型以及技術(shù)服務(wù)。對(duì)于Meadowlark SLM有興趣或者任何問(wèn)題，都?xì)g迎通過(guò)電話、電子郵件或者微信與我們聯(lián)系。

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