小核酸藥物行業(yè)發(fā)展迅速，至今已有15款藥物獲批，成為繼小分子和抗體藥物后的第三波創(chuàng)新藥浪潮。然而受限于遞送手段的限制，目前已上市的小核酸藥物僅能針對肝臟靶點。小核酸抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-oligonucleotide conjugates，AOC）利用抗體將治療性寡核苷酸遞送至特定細胞或組織，將抗體的組織特異性優(yōu)勢，與小核酸的靶點特異性優(yōu)勢相結(jié)合，拓展了寡核苷酸藥物的組織/細胞靶向性。近年來，諸多公司將注意力和資源集中在開發(fā)基于AOC技術(shù)的先進藥物上，2021年11月，AOC先驅(qū)Avidity Biosciences公司的小核酸抗體偶聯(lián)物AOC1001的I期臨床試驗完成首例患者給藥，標(biāo)志著全球首款A(yù)OC藥物進入臨床試驗。

AOC藥物作為具有巨大潛力的新型生物藥物，其藥物質(zhì)量的控制對于安全性和有效性至關(guān)重要。一方面，每個部分包括抗體的純度、特異性、親和力等，小核酸的純度、穩(wěn)定性，連接子的穩(wěn)定性、細胞毒性等需要檢測；另一方面，完整AOC藥物本身的質(zhì)量包括抗體和小核酸的偶聯(lián)比例、游離抗體、游離小核酸的比例等都需要嚴格監(jiān)測。

本實驗使用的樣品為一種單抗偶聯(lián)寡核苷酸的AOC藥物，濃度為40 mg/mL。IgG的理論分子量為147244 Da，寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)的理論分子量為6581Da，與IgG連接前需先對ODN進行修飾，將ODN的5`-端磷酸骨架與HS-C6結(jié)構(gòu)反應(yīng)，形成HS-C6修飾的ODN(分子量6777Da)。

IgG和ODN的連接方式為Sulfo-SMCC偶聯(lián)方式，偶聯(lián)過程見圖2，整個偶聯(lián)過程分為兩步，第一步IgG的游離-NH₂與SMCC反應(yīng)形成馬來酰亞胺激活抗體(maleimide-activated IgG)，之后再與連接在HS-C6的ODN反應(yīng)，得到最終的偶聯(lián)產(chǎn)物。

在CZE條件下可有效分離游離IgG，AOC及游離ODN分子。標(biāo)準品和樣品的分離結(jié)果見圖3。

在CZE中，樣品的分離基于分子在電場作用下荷質(zhì)比的差異。在堿性緩沖液條件下，由于樣品中的IgG、ODN以及AOC都帶負電荷，在正電場下荷質(zhì)比越大的分子遷移速度越慢。荷質(zhì)比主要由電荷數(shù)和分子量決定，游離IgG分子量最大，帶的負電荷數(shù)量比較少，荷質(zhì)比小，因此會最先出峰。游離ODN由于分子量最小，電荷數(shù)最高，因此荷質(zhì)比最大，會最后出峰。對于AOC來說，其分子量與IgG相比變化不大，而電荷數(shù)隨著ODN的偶聯(lián)而增大，因此遷移速度會慢于IgG，且偶聯(lián)的OND數(shù)目越多，電荷增加越多，遷移速度越慢。遷移時間順序為，IgG < IgG-(n)ODN<odn< span="">。在本次實驗中，IgG標(biāo)準品的遷移時間在6.25 min，ODN標(biāo)準品的遷移時間在20.95 min，與上述理論推導(dǎo)出峰順序一致。

為了驗證CZE中推斷的峰2、3、4是否為IgG偶聯(lián)了不同數(shù)量ODN的峰，并確認偶聯(lián)的數(shù)量，我們嘗試了HRMS的方法。通過HRMS分別檢測了IgG標(biāo)準品和AOC樣品， MS結(jié)果見圖4。在 OS軟件中對IgG標(biāo)準品TOF MS圖譜進行解卷積，確認IgG的分子量為147244.2Da，在AOC樣品TOF MS圖譜的解卷積結(jié)果中也檢測到分子量為147246.3Da的一簇峰，推斷是游離IgG的峰，與IgG標(biāo)準品相比多的2Da可能是由于AOC樣品異質(zhì)性較強導(dǎo)致的解卷積后分子量差異。在AOC解卷積圖譜中還檢測到比游離IgG分子量多6994.6Da, 13987.8Da以及20847.4Da的峰，鑒定為IgG連接1個ODN(IgG-1ODN)，2個ODN(IgG-2ODN)和3個ODN(IgG-3ODN)的峰。增加的6994.6Da為IgG上連接了SMCC linker及HS-C6修飾的ODN分子產(chǎn)生的分子量。

進一步將原始數(shù)據(jù)上傳至 Biologics Explorer軟件進行完整分子量分析，計算IgG，IgG-1ODN，IgG-2ODN及IgG-3ODN各峰的峰面積見圖5(Volume)，通過峰面積計算各峰的比例分別為32.90%，44.54%，20.52%及2.03%。

CZE與HRMS兩種結(jié)果計算的各組分比例比較如表2。從表2可以看出，CZE和HRMS兩種技術(shù)計算的不同組分的比例比較一致。