凝膠電泳是許多分子生物學實驗的重要部分。建立核酸電泳需采取一系列步驟來實現(xiàn)核酸樣品的Z佳分離和分析。核酸凝膠電泳工作流程中的關鍵步驟包括:

1.選擇和制備凝膠

a.瓊脂糖凝膠 b.聚丙烯酰胺凝膠 c.凝膠制備中的緩沖液選擇

2.準備標準品和樣品

a.核酸梯度選擇 b.樣品和梯度準備 c.加載染料和緩沖液選擇

3.運行電泳

a.電泳緩沖選擇 b.電壓 c.電泳時間

4.在凝膠中可視化樣品

a.熒光染色 b.紫外陰影

5.記錄凝膠

a.熒光成像 b.射線自顯跡法

圖1.核酸凝膠電泳的5大關鍵步驟。

1.選擇和制備凝膠 

瓊脂糖（9012-36-6）和聚丙烯酰胺（9003-05-8）是核酸分離中Z常用的兩種凝膠基質(zhì)。兩種材料都是三維基質(zhì)，孔徑大小適合核酸分離，且與樣品間無反應?？赏ㄟ^改變基質(zhì)的百分比來調(diào)整孔徑大小，從而有效分離不同大小的核酸。

有關瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺之間的選擇，主要取決于核酸樣品的大小和所希望達到的分辨率，雖然凝膠灌制和樣品回收的方法也可考慮（表1）。瓊脂糖凝膠的孔徑大小非常理想，可分離0.1-25 kb范圍內(nèi)的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔徑較小，可用于分離小于1 kb的核酸分子。某些情況下，可采用聚丙烯酰胺凝膠以獲得片段小于100bp的單堿基分辨率[1]。

a.瓊脂糖凝膠

關于凝膠制備，瓊脂糖凝膠通常以粉末形式提供，近年來也有方便的預稱重片可供使用。為簡化工作流程、節(jié)省時間，可考慮預制瓊脂糖凝膠，其在某些 市售系統(tǒng)中作為集成單元來運行、可視化和分析。

制備您自己的瓊脂糖凝膠，凝膠比例計算為:

凝膠%(w/v)=(瓊脂糖g/緩沖液ml)x 100%

凝膠灌制時，如果使用了熒光核酸染色劑（溴化乙錠1239-45-8），可在凝膠灌制時加入推薦濃度（例如，溴化乙錠0.5 μg/mL）。

表2為不同長度的DNA片段分離提供了推薦的瓊脂糖凝膠百分比[2]。一般而言，較高比例的凝膠便于更小片段、更好的分離和分辨（圖2）。注意，低比例凝膠十分脆弱且難以操作，而高比例凝膠則較渾濁，且會干擾可視化。

圖2.不同百分比的瓊脂糖凝膠中DNA片段的流動性。在相同條件下（包括運行時間），在1%、2%和3%瓊脂糖凝膠上分離出相同的DNA階梯。1kb片段用紅色星號表示，以供比較。

瓊脂糖成分

瓊脂糖是一種經(jīng)過純化的瓊脂，是海洋紅藻細胞壁的碳水化合物結構組成部分。 瓊脂糖是一種分子量約為12萬的無支鏈（線性）聚合物，含有800-1000個單糖。 瓊脂糖鏈由一種重復的異二糖-即-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖通過1-4糖苷鍵結合而成。 雙糖單位，也稱瓊脂二糖，通過a-1、3連接形成了一個鏈（圖3）。

圖3.瓊脂糖的結構單元。瓊脂糖由400-500個瓊脂二糖單位組成。

瓊脂糖溶液加熱并冷卻后，就會形成凝膠基質(zhì)。其孔洞直徑從50到200納米不等，由凝膠濃度控制。溫度高于90℃，瓊脂糖便會融化，變成無規(guī)卷曲。冷卻后，兩個瓊脂糖鏈形成由氫鍵連接的螺旋纖維。進一步冷卻至膠凝固點以下（通常小于40°C），則會有更多氫鍵連接形成螺旋束網(wǎng)絡，進而形成具有三維網(wǎng)格的凝膠（圖4）[3,4]。 由于氫鍵，瓊脂糖形成的凝膠加熱可逆。因此，通過溶解含有目的片段的凝膠，可提取電泳分離出的核酸。

圖4.通過加熱和冷卻改變?nèi)芤褐协傊堑慕Y構。

對大于10kbp DNA的提取，低熔點（LMP）的瓊脂糖是較合適的選擇。LMP瓊脂糖在65度左右（1%的凝膠）融化—相對較低的溫度，確?？梢詼睾偷靥崛∧z中完整的核酸大分子。 LMP瓊脂糖的低凝膠溫度（~25°C）使其成為凝膠內(nèi)酶反應的理想選擇（例如，連接）。酶在半固態(tài)的瓊脂溶液中處于活躍狀態(tài)。

b.聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺-丙烯酰胺和交聯(lián)劑—雙丙烯酰胺（簡稱為“bis”）的組分-可以粉末形式提供，但為了方便通常預先制備成原液。該粉末和液體形式是為大家所知的神經(jīng)毒素，應使用實驗室防護性設施，小心操作。在凝膠中，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺（以%T表示）的總濃度決定了孔隙大小—通常直徑為20-150納米。百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子也更小。表3展示了常用的凝膠比例[2]。

核酸分離，通常采用3–30%（%T）的聚丙烯酰胺凝膠。除%T之外，雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑）與總丙烯酰胺（%C）的重量百分比是聚丙烯酰胺凝膠孔隙大小和樣品分離的的關鍵（表4）。

%T和%C可以表示為：

%T(w/v)=[(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g/緩沖液ml]x 100%

%C(w/w)=[雙丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g]x 100%

聚丙烯酰胺的基本原理

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體聚合而成的聚合物，通常與雙丙烯酰胺或N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺結合使用。交聯(lián)劑雙丙烯酰胺含有兩個單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺。聚合是被TEMED 催化（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）的自由基反應-通常由過硫酸銨（APS）引發(fā)（圖 5）。因此，在既定溫度下，APS和/或TEMED的濃度決定了聚合速率。

圖5.丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺，雙丙烯酰胺結構展示。雙丙烯酰胺含有兩個單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺（紅色）。

c.凝膠制備中的緩沖液選擇

使用具有導電性的離子溶液制備瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠，確保核酸在電泳過程中具有遷移性。電泳過程中，凝膠和電泳緩沖液通常使用相同類型的緩沖液，以保持相同的pH值和離子強度。核酸電泳常用的兩種緩沖液為Tris-醋酸鹽EDTA （TAE）和Tris-硼酸鹽EDTA （TBE），兩者都有接近中性的pH值，有利于帶負電荷的核酸。

為分析單鏈DNA或RNA，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠通常在變性條件下制備和運行。變性條件會破壞核酸之間形成的氫鍵，從而減少像發(fā)夾環(huán)這樣二級結構的形成。因此對RNA分離和分析而言，變性電泳更常用。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠核酸電泳中常用的變性緩沖液包括:

1. 瓊脂糖：磷酸鈉緩沖液中的乙二醛和DMSO、NaOH-EDTA緩沖液、MOPS緩沖液中的甲醛或甲酰胺等

2. 聚丙烯酰胺: TBE緩沖液中的尿素

2.準備標準品和樣品

a.核酸標準品選擇

當運行凝膠時，含有已知大小的核酸參照樣品通常被稱為標準品、標記或 分子量標準，用于目的樣品大小的估計。 在為給定樣品選擇合適的分子量標準時，需考慮如下因素:

1. Ladde類型（例如DNA或RNA），片段結構（例如單鏈或雙鏈），構象（例如超螺旋、開環(huán)或線性）以確保對遷移進行適當比較

2. 片段的數(shù)量和適當?shù)姆蛛x形式，用于大小的估計

3. 預期用途，如分子量標準是設計用于定性分析還是精確的定量測定

4. 不同類型凝膠適用的分子量標準（例如，部分預制凝膠推薦設計 特定分子量標準以獲得Z佳運行結果）

5. 上樣染料的性質(zhì)，避免目的條帶模糊（圖6）

6. 上樣緩沖液與使用凝膠的兼容性（例如，緩沖液的鹽濃度會影響樣品的遷移）

早期，DNA的大小標準主要來源于病毒基因組片段(（例如,λφX174）和細菌質(zhì)粒（如pUC19）的限制內(nèi)切。該標準物在內(nèi)切、樣品純度和電泳中帶型的重現(xiàn)性方面存在問題。而后，從連接反應和/或PCR中獲取的含有片段的分子量標準，因具有再現(xiàn)性且可產(chǎn)生預期大小的片段，而備受青睞。如今，因為色譜純化片段實現(xiàn)了質(zhì)量、帶型、強度和數(shù)量等方面的更高控制，被視為分子量標準黃金標準（圖6）。

圖6.DNA 分子量標準差異。 分子量標準 #2由色譜純化的DNA片段組成，存在于上佳的上樣緩沖液中，可產(chǎn)生相等或預期強度的條帶，并且不含有條帶污點，無染色陰影。 與此相反，分子量標準 #1采用較老技術制造，并存在于次優(yōu)組分的緩沖液中。

此外，還設計出室溫下穩(wěn)定、適合運輸和儲存，以及方便和少環(huán)境影響的分子量標準。而預混合，即用型分子量標準也可供選擇—添加了Z佳濃度、可直接上樣到凝膠的上樣染料的分子量標準。

注意，由不同制造商生產(chǎn)、描述相同（例如，1kb或100bp）的分子量標準，包含DNA片段的數(shù)量、大小和密度可能會有所不同（圖7）。使用前，請參考制造商提供的指南和協(xié)議，獲取分子量標準組成及其使用用途準確而詳細的說明。

與DNA分子量標準不同，RNA分子量標準通常與含有變性劑的上樣緩沖液一同提供。變性劑可維持RNA的單鏈形式，確保樣品可預測的遷移和分離結果。當運行RNA凝膠電泳時，應避免使用DNA分子量標準，因為雙鏈分離，在變性條件下使用會導致非規(guī)則方式分離。

圖7.兩個不同供應商A和B，提供具有相同描述的DNA分子量標準片段組成差異。

b.樣品和標準品準備

須計算上樣到凝膠中的DNA量，以確保目的條帶良好分離，并用于可視化和檢測。雖然用熒光染料足以檢測1-100ng/條帶的DNA，但Z小可檢測量取決于所用染料[6]。注意，樣品或標準品的超載會造成條帶污點并遮蓋附近條帶，從而導致條帶分辨不清，特別是片段大小相似時（圖8A）。

圖8.次優(yōu)樣品分離。 (A) 負載影響條帶分辨率。 (B) 上樣量過低會導致條帶扭曲。

在上樣緩沖液中準備好樣品和分子量標準，其Z 終的體積通常占膠孔體積的30%。 由于孔底分布不均勻（圖8B），使用較少的上樣體積會導致條帶扭曲。對于含有DNA結合蛋白或粘性末端的樣品，凝膠上樣之前，混合物需加入至含有SDS的上樣染料中一同加熱，因為蛋白質(zhì)結合以及DNA片段之間的相互作用會導致分離效果不佳（圖10B）。

c .上樣染料和緩沖液選擇

制備凝膠電泳時，樣品中添加了凝膠上樣緩沖液 (通常是6X或10X的原液)。 上樣緩沖液包括如下組分:
 

1. 密度成分，如甘油或蔗糖，增加樣品粘度，確保樣品沉入孔中。

2. 鹽，如Tris-HCl，為樣品創(chuàng)造良好的離子強度和pH值環(huán)境。 高鹽濃度的上樣緩沖液會產(chǎn)生更大片或扭曲的條帶以及污點。

3. 金屬螯合劑，如EDTA，可阻止樣品中的核酸酶降解核酸。

4. 染料 為監(jiān)測樣品的上樣、電泳進展和pH值變化提供了顏色指示。 部分上樣緩沖液可能包含多個染料，以便有效跟蹤樣品中不同大小分子的遷移。

通常，上樣染料都是帶負電荷的小分子，因此遷移方向與核酸相同。 其中有的顯示pH值顏色，上樣和運行時可作為樣品的pH指示劑(圖9A)。 常用染料包括溴酚藍、二甲苯青,苯酚紅,和橙色G。選擇上樣緩沖液時,需注意染料的表面遷移(s)(圖9B, 表5和6)以避免遮蓋目的核酸條帶,特別是分子大小接近時(圖9C)。 染料遮蓋會影響目的條帶的分析和量化，導致結果不可靠。

圖9.(A)中性pH中染料顏色。(B)在TAE和TBE緩沖液中不同百分比瓊脂糖里的染料遷移。(C)在可視化過程中染料陰影遮蓋條帶。

有時,上樣緩沖液包含清洗劑或還原劑，如SDS, 尿素和甲酰胺，以用于變性。此類添加劑可破壞核酸分子內(nèi)部和分子間的相互作用，促成線性或單鏈的分子構象。為獲得Z佳分離結果，應將樣品和變性劑加入至上樣染料中一同加熱（圖 10A）。對來源于酶反應的雙鏈DNA電泳，可將SDS添加到上樣緩沖液，以破壞蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用，防止樣品遷移性改變（圖10B）。

圖10,熱量、SDS對樣品電泳的影響。(A) 在不加熱處理的情況下，將含有RNA分子量標準的變性緩沖液加入凝膠中。 (B) 在有或無SDS的上樣緩沖液中準備來源于限制性內(nèi)切和連接反應的DNA樣品。 在凝膠上樣前，加熱SDS中的樣品。

3.運行電泳

在凝膠、標準品和樣品制備后，進行電泳。拆卸梳子和添加電泳緩沖液前，凝膠須完全凝固。凝膠梳應平穩(wěn)地向上提起，以免撕裂凝膠、扭曲膠孔。移除梳子和添加緩沖液后，注意清除孔里的氣泡。對于聚丙烯酰胺凝膠，應用緩沖液徹底沖洗膠孔，以清除殘留未聚合的丙烯酰胺。

水平凝膠應朝向凝膠盒，樣品孔位于負極一側，以便在電泳啟動后，將樣品移動至正電極側（圖11A）。該方向可記為“跑向紅色”，因為正電極通常為紅色。 垂直凝膠盒中，膠孔設計在頂部（圖11B）。

圖11.水平和垂直電泳系統(tǒng)的凝膠裝置。 箭頭表示電泳中核酸遷移的方向。

a.電泳緩沖液選擇

電泳緩沖液為具有緩沖能力的離子溶液，通常在凝膠中使用，以保證電流流動同時防止pH值變化。電泳過程中，由于電子流動，負極逐漸偏向堿性，正極逐漸偏向酸性，從而導致水電解和pH值改變（表6）。氫氣和氧氣的釋放會引起電極起泡，這是凝膠運行的跡象。理想情況下，電泳緩沖液和凝膠制備緩沖液應相同，以確保有效的導電性。

表6.兩個電極的化學反應和pH值變化。

電泳緩沖液的選擇取決于樣品大小、運行時間和后電泳過程，其中Tris-醋酸鹽EDTA（TAE）和Tris-硼酸 EDTA（TBE）是Z常用的兩種緩沖液（表 7）[2,7]。

1. 因為不容易形成污點，TAE適用于>1500bp的片段。由于緩沖能力較低，TAE更適合短時間的電泳運行(例如<2小時)。TAE緩沖能力較低，長時間運行凝膠會導致過熱，樣品變性和/或擴散以及凝膠融化（可能）。

2. TBE緩沖能力較高，不易導致過熱，因此更適合長時間運行。對于較短片段的分離，TBE效果更佳，而在TBE中，dsDNA遷移得更慢。TBE可抑 制酶，因此不適合涉及酶學步驟的下游應用，如限制內(nèi)切、克隆和PCR。

使用離子強度高于1X TAE或0.5-1X TBE緩沖液，可更快地移動樣品，但由于高導電性會產(chǎn)生大量的熱量，容易導致樣品變性和凝膠損傷。

凝膠應完全浸在緩沖液中，以確保離子流動，防止凝膠干（圖12A）。然而，當使用水平凝膠時（例如，瓊脂糖），凝膠上的緩沖液深度應低于3–5mm。緩沖液過高（>5 mm）會導致核酸遷移性降低，加大條帶扭曲和過熱。

圖12.電泳緩沖液對電泳的影響。(A) 在電泳過程中，凝膠的頂部部分未被浸沒。(B) 在低于推薦濃度的鹽濃度緩沖液中運行凝膠（與凝膠制備中使用的緩沖液不同）。

注意，變性瓊脂糖的電泳緩沖液可能既不是TAE，也不是TBE，因為這些凝膠可能在不同的緩沖液中制備，如磷酸鈉和MOPS。選擇與所用凝膠兼容的電泳緩沖液非常重要（圖12B）。

b.電壓

采用恒定電壓、電流或功率通過凝膠，施加電勢，開始運行凝膠。核酸電泳中常用恒壓，一般為5–10 V/cm。

施加的電壓(V)=電極間的距離(cm)x建議V/cm

可根據(jù)需要分離的DNA片段的大小調(diào)整電壓，也可以根據(jù)所使用的電泳緩沖液的類型進行調(diào)整（表 8）。市售核酸分子量標準通常提供建議電壓，以便每個產(chǎn)品片段實現(xiàn)Z佳分離。注意，電壓極低會減緩核酸的遷移，從而導致小分子的擴散和分辨率過低（圖13A）。另一方面，電壓過高，會導致較差的分離效果和樣品污點；有時，還會造成緩沖液過熱，“微笑型條帶”，甚至是樣品變性（圖13B）。

圖13. 電壓對DNA電泳的影響。 (A)低電壓導致條帶分辨率差和擴散。 (B)高電壓導致“微笑型條帶”。

某些情況下，可將溫度探頭連接至凝膠裝置，以幫助控制緩沖液的冷卻和加熱。 電泳運行>2小時，緩沖液的冷卻和再循環(huán)可改善樣品分離。變性凝膠允許緩沖液加熱至55°C，從而改善核酸單鏈形式，提升實驗結果。

c.運行時間

凝膠長度、所用電壓和樣品中的分子大小決定電泳所需的時間。通常，電泳會持續(xù)到目的條帶遷移至凝膠長度的40-60%。凝膠運行的特定時間，可觀察到上樣染料的相對位置，直至溴酚藍染料已遷移約60%的凝膠長度和/或橙G染料已遷移80%的凝膠長度。此外，應監(jiān)測運行時間，以確保樣品或標準品中Z小的分子不移出凝膠。注意，運行時間過短則不能完全分辨條帶（圖14）。含有示蹤染料的DNA分子量標準可協(xié)助監(jiān)測凝膠的運行，同時也可確保條帶不被染料所遮蓋。

圖14.運行時間對樣品分離的影響。

4.在凝膠中可視化樣品

凝膠運行完成后，需對樣品進行可視化分析。由于普通照明環(huán)境下，核酸不可見，因此需要一種可視化的檢測方法。如表9所述，可用方法在樣品檢測中，提供了不同的靈敏度和增益范圍[6]。

a.熒光染色

現(xiàn)有的染色劑中，因熒光染料易于使用，靈敏度高，所以在樣品檢測中應用Z為廣泛(圖15)。 當用適當波長激發(fā)時，染料發(fā)出可見光(即，熒光)。熒光強度與其和核酸結合的數(shù)量有關—這是檢測和定量測定電泳中核酸的基礎。

圖15.不同類型的核酸結合染料。

溴化乙錠(EtBr) 染色時間短（約30分鐘），靈敏度高（可檢測到1 ng雙鏈DNA/條帶），為核酸電泳中的常用熒光染料。還可考慮另一種染料，原因如下:

1. 誘變和處置: 溴化乙錠是高度誘變劑，所以熒光染料的 危險性較小，無需特殊處理，在核酸電泳中可提供安全工作流程(圖16)。

2. 靈敏度：靈敏度高于EtBr的熒光染料，適合檢測少量樣品(圖16)。 因為有較少的堿基堆積，單鏈核酸的可視化通常需要更多樣品和/或嵌入染料。 因此， 優(yōu)先結合單鏈核酸的染料是RNA電泳樣品檢測的Z佳選擇。

3. 紫外線損害：可用低能量藍光（而非紫外光）來激發(fā)的熒光染料對核酸結構損傷較小，其靈敏度（圖17A）不僅相同，甚至更高。 因此，電泳中使用藍光激發(fā)可提高下游的成功應用，如克隆和測序（圖17B）。

圖16.特性增強的溴化乙錠替代品

圖17.(A)常見核酸染色的激發(fā)和發(fā)射光譜。Z有效的波長被稱為激發(fā)極大值。SYBR安全與SYBR金染料通過藍光和較低的紫外光可Z 大程度激發(fā)。(B)用藍光(針對SYBR安全染料)或紫外光(溴化乙錠)后的克隆效率，用于在電泳過程中顯示克隆插入。用x-Gal培養(yǎng)皿上形成的藍色菌落數(shù)量來衡量膠-純化lacZ片段的克隆效率，其表明已將功能(未突變的)基因插入到載體中。

b.紫外陰影

在染料染色處，可通過稱作紫外陰影的方法間接觀察核酸，利用核酸[8]來吸收紫外線。該方法通常用于通過電泳分離和純化寡核苷酸和RNA，這種情況下，簡單檢測已足夠，和/或使用嵌入染料會影響下游的應用。為通過紫外陰影進行檢測，需要納克到微克的樣品，并使用薄而透明的凝膠（如聚丙烯酰胺）以確保紫外線的吸收和透射。紫外陰影方法中，電泳后將凝膠從盒中取出（以便Z大程度檢測），用透明的塑料薄膜包裹后放置在UV-熒光薄層色譜板上。當凝膠至于紫外線輻射下時，核酸條帶的吸收會在TLC板上投射陰影（圖18）。將所需大小凝膠的陰影部分剪去，以作進一步處理。

圖18.紫外陰影使分離的片段顯象。

5.記錄凝膠

a.熒光成像技術

可視化后，核酸凝膠通常被存檔記錄下來，用于記錄和分析電泳結果。如果樣品被熒光染料染色，需特殊設備以適當?shù)墓庠醇ぐl(fā)染料，使其顯象并捕捉凝膠圖像。激發(fā)光源在凝膠上，稱為反射照明器（類似于手持式紫外線燈），或在凝膠下，稱為透照器 (圖19)。由于反射照明器上的光源位置較遠，所以樣品收到的能量較少。這樣可以減少紫外線對核酸的損害，但也會降低凝膠條帶的信號。另一方面，透照器可為條帶提供更高的信號，但由于輻射接近凝膠，會增加紫外線造成的傷害。

圖19.反射照明器和透照器。

b.放射自顯影法

在放射性核酸的電泳過程中，凝膠電泳后會暴露在x射線膠片上，這一過程即稱為 放射自顯影法。條帶輻射的強度可用光密度測定來定量。

綜上所述，核酸電泳工作流程采用多種步驟和試劑來分離和分析樣品。為您的樣品選擇合適工具，并識別工作流程的優(yōu)缺點，可顯著提高分子生物學應用的電泳結果。

參考文獻
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