1. 凝膠介質(zhì)的選擇
      凝膠介質(zhì)的選擇主要是根據(jù)待分離的蛋白和雜蛋白的分子量選擇具有相應(yīng)分離范圍的凝膠，同時還需要考慮到分辨率和穩(wěn)定性的因素。比如，如果是要將目的蛋白和小分子物質(zhì)分開，可以根據(jù)他們分配系數(shù)的差異，選用SephadexG-25和 G-50；對于小肽和低分子量物質(zhì)的脫鹽，則可以選用Sephadex G-10、G-15以及 Bio-GelP-2 或 P-4；如果是分子量相近的蛋白質(zhì)，一般選用排阻限度略大于樣品中ZG分子量物質(zhì)的凝膠。具體凝膠過濾色譜介質(zhì)應(yīng)用如下：

2. 凝膠介質(zhì)的預(yù)處理

        凝膠在使用前應(yīng)用水充分溶脹（膠：水=1：10），自然溶脹的耗時較長，可采用加熱的方法使溶脹加速，即在沸水浴中將凝膠升溫至沸，1~2h即可達到溶脹。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌，靜置，傾去上層混懸液，除去上清液中的凝膠碎塊，重復(fù)數(shù)次，直到上清澄清為止。

3. 色譜柱的選擇

        色譜柱的體積和高徑比與色譜分離效果密切相關(guān)，凝膠柱床的體積、柱長和柱的直徑以及柱比的選擇必須根據(jù)樣品的數(shù)量，性質(zhì)和分離目的進行確定。組別分離時，大多采用 2~30cm 長的色譜柱，柱床體積為樣品溶液體積的 5倍以上，柱比一般在 5~10 之間；而分級分離一般需要 100cm 左右的色譜柱，并要求柱床體積大于樣品體積 25倍以上，柱比在20~100之間。

4. 凝膠柱的填裝

    凝膠色譜柱與其它色譜方法不同，溶質(zhì)分子與固定相之間沒有力的作用，樣品組分的分離完全依賴于他們各自的流速差異。裝住時關(guān)住柱子下口，在柱內(nèi)加入約1/3 柱床體積的水或緩沖液，然后沿著柱子一側(cè)將緩沖液中的凝膠攪拌均勻，緩慢并連續(xù)的一次性注入柱內(nèi)。待凝膠沉積約 5厘米左右時，打開柱子下口，控制流速在 1ml/min。

5. 樣品的處理與上樣

    根據(jù)樣品的類型和純化分析，需要選擇合適的緩沖液，為了達到良好的分析效果，上樣量必須保持在較小的體積，一般為柱床體積的1%~5%，蛋白質(zhì)樣品上樣前應(yīng)進行濃縮，使樣品濃度不大于4%（樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)），但需要注意的是，較大分子量的物質(zhì)，溶液粘度會隨濃度增加而增大，使分子運動受限，影響流速。上樣前，樣品要經(jīng)濾膜過濾或離心，除去可能堵塞色譜柱的雜質(zhì)。

6. 洗脫與收集

    凝膠過濾色譜的緩沖液用單一緩沖液或含鹽緩沖液作為洗脫液即可，主要考慮倆個方面的原因：蛋白的溶解性和穩(wěn)定性。所用的緩沖液要保證蛋白質(zhì)樣品在其中不會變性或沉淀，PH 應(yīng)選在樣品較穩(wěn)定、溶解性良好的范圍之內(nèi)，同時緩沖液中要含有一定的鹽（NaCL），對蛋白質(zhì)起穩(wěn)定和保護作用。洗脫過程中始終保持一定的操作壓，流速不可過高，保持在 0.5~3.0mL/min即可。