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張曉夕

本文中展示了中檢院?jiǎn)慰故襔新發(fā)表在Analytica Chimica Acta雜志（IF=6.2）上，對(duì)SARS-CoV-2重組蛋白疫苗進(jìn)行全面深入表征的研究結(jié)果。該產(chǎn)品包含多種翻譯后修飾，如糖基化、脫酰胺和氧化等，異質(zhì)性極高，單一技術(shù)平臺(tái)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)此類重組蛋白產(chǎn)品徹底、準(zhǔn)確的表征，故整合多種理化分析技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)品表征就顯得尤為必要。本文中展示了整合多種分離技術(shù)的創(chuàng)新串聯(lián)高分辨質(zhì)譜工作流程，包括超高效液相色譜(Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC)、離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography, IEX) 和成像等電聚焦毛細(xì)管電泳 (Imaged Capillary Isoelectric Focusing, icIEF)分別與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，S次對(duì)該SARS-CoV-2 重組蛋白疫苗進(jìn)行了全面、深入的表征。

本工作的一個(gè)突出亮點(diǎn)在于尖端 icIEF-MS 在線直聯(lián)和 icIEF餾分收集技術(shù)對(duì)于揭示SARS-CoV-2重組疫苗電荷異質(zhì)性的重要性。

研究人員首先對(duì)樣品進(jìn)行了還原/非還原條件下胰酶酶解，并分別使用Thermo Scientific? Q Exactive? Plus Orbitrap? 超高分辨質(zhì)譜儀和Orbitrap Fusion? Lumos? Tribrid? 超高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行了液質(zhì)聯(lián)用肽圖分析。使用Q Exactive? Plus Orbitrap? 超高分辨質(zhì)譜儀的高能碰撞解離（High Energy Collision Dissociation, HCD）二級(jí)碎裂模式，由于HCD模式下糖鏈也會(huì)被打碎，對(duì)于沒有切除N/O糖鏈的樣品，肽圖分析可達(dá)到89.5%的序列覆蓋度。而使用Lumos? Tribrid? 超高分辨質(zhì)譜儀的HCD二級(jí)碎裂觸發(fā)電子轉(zhuǎn)移/ 高能碰撞解離(Electron-Transfer/Higher-Energy Collision Dissociation, EThcD)二級(jí)碎裂模式，可以監(jiān)控糖肽HCD碎裂后產(chǎn)生的糖鏈特征性碎片離子，隨之對(duì)同一條糖肽進(jìn)行EThcD二級(jí)碎裂，保留肽段上的完整糖鏈修飾，從而可以在肽圖分析層面同時(shí)對(duì)糖肽序列、糖基化修飾位點(diǎn)和糖鏈分子量進(jìn)行鑒定。

圖2A和2B分別展示了EThcD二級(jí)碎裂得到的O-糖肽及高唾液酸化N-糖肽的二級(jí)譜圖，證明了EThcD碎裂模式在糖肽分析中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。圖2C展示了采用EThcD二級(jí)碎裂，鑒定到的N-糖基化位點(diǎn)及糖型分布情況，表1則對(duì)EThcD二級(jí)碎裂肽圖層面鑒定到的O-糖糖鏈種類和相對(duì)含量與傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)熒光標(biāo)記的O-糖鏈（UHPLC-FLD-MS）結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，可見兩種方法分別鑒定到的O-糖型趨勢(shì)一致，但EThcD二級(jí)碎裂肽圖分析可以在一針進(jìn)樣中同時(shí)獲得糖基化修飾位點(diǎn)和糖型信息，糖型種類更為豐富，還可以獲得未發(fā)生糖基化修飾的比例，這些都是質(zhì)譜法相對(duì)于傳統(tǒng)熒光標(biāo)記法檢測(cè)O糖鏈的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。對(duì)于沒有切除N/O糖鏈的樣品，EThcD二級(jí)碎裂肽圖分析可達(dá)到97.7%的序列覆蓋度，僅切除N-糖鏈后，序列覆蓋度可達(dá)99.7%，并且可以確定每段單體序列上分別有2個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)，完整蛋白上總共有6個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)和3個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)。

表1. EThcD 肽圖分析與傳統(tǒng)熒光標(biāo)記法檢測(cè)O糖鏈定性定量結(jié)果對(duì)比。左欄，EThcD 肽圖分析法。右欄，傳統(tǒng)熒光標(biāo)記法。

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肽圖分析結(jié)果初步揭示了N/O糖基化修飾導(dǎo)致的分子高度異質(zhì)性。接下來(lái)，研究人員通過使用不同的糖苷酶，切除對(duì)應(yīng)種類的糖鏈后，在Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀上進(jìn)行非變性條件下完整蛋白分子量分析。非變性條件可減少蛋白電荷態(tài)，進(jìn)而降低相鄰質(zhì)譜峰之間的互相干擾，從而獲得更準(zhǔn)確的分子量分析結(jié)果，但此技術(shù)對(duì)于質(zhì)譜儀的靈敏度有較高要求。圖3A-F展示了分別使用不同種類糖苷酶處理樣品后，非變性條件完整蛋白分子量分析的結(jié)果。Orbitrap質(zhì)譜平臺(tái)兼具高靈敏度、高質(zhì)量精度和高分辨率的優(yōu)點(diǎn)為此類復(fù)雜樣品的非變性條件下完整蛋白分子量分析提供高質(zhì)量分析結(jié)果。由于樣品中具有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，將完整蛋白分子量分析與肽圖結(jié)果相結(jié)合，可以得到蛋白上不同位點(diǎn)的糖鏈修飾分布情況。圖3G展示了3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)上不同糖型修飾的分布情況，可見排名前三位的組合依次為2xGalNAc-3SG + 1xGalNAc-6S-3SG (39.05%)，3xGalNAc-3SG(28.52%)和1xGalNAc-3SG+2xGalNAc-6S-3SG (19.86%)。

復(fù)雜的糖基化修飾導(dǎo)致此樣品具有極高的電荷異質(zhì)性。研究人員使用了尖端的iCIEF-MS直聯(lián)技術(shù)，對(duì)該樣品進(jìn)行基于電荷異質(zhì)性的分離，隨后在線直聯(lián)高分辨質(zhì)譜測(cè)定每個(gè)電荷異構(gòu)體的分子量。如圖4A-B所示，沒有切除糖鏈的樣品經(jīng)iCIEF分離后得到18個(gè)峰，每個(gè)峰中仍含有多個(gè)不同組分。圖4C對(duì)peak1和peak2的原始譜圖進(jìn)行了對(duì)比，可見明顯區(qū)別，圖4D的解卷積結(jié)果對(duì)比進(jìn)一步揭示了peak1和peak2的不同。得益于iCIEF技術(shù)對(duì)復(fù)雜樣品的分離，以及Orbitrap超高分辨質(zhì)譜平臺(tái)的優(yōu)異性能，不切除糖鏈即可對(duì)復(fù)雜糖蛋白進(jìn)行完整分子量分析，從而得到詳實(shí)且Z接近樣品原始狀態(tài)的N/O糖基化修飾信息。

原文參考鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.342349

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