做實驗就像開盲盒，你永遠不知道這一次的qPCR會給你“驚喜”還是“驚嚇”。
不管是在新課題的預實驗中披荊斬棘，還是在老項目的驗證中按部就班，那些不走尋常路的擴增曲線和熔解曲線，總能精準地找上門來。
別急著嘆氣，也別盲目地重復加樣！雖然這些異常曲線看起來千奇百怪，但它們其實都是會說話的“說明書”。只要靜下心來，掌握一套系統(tǒng)的分析思路，搞清楚背后的原理，你就能分分鐘拿捏它們，順利拿到完美數(shù)據(jù)，從此告別無效加班的噩夢！
? 原因分析：
熒光定量儀器參數(shù)設置錯誤，上機前對應熒光信號采集開關(guān)(小相機)沒有打開。
儀器界面展示處以ABI Q5為例
? 解決方案：
可在問題數(shù)據(jù)的運行程序中檢查，相關(guān)采集開關(guān)是否正常開啟。若未正常開啟，則需要重新準備上機反應體系，設置好對應的參數(shù)，打開采集開關(guān)再次檢測。
擴增曲線線性圖顯示為一條筆直的線或?qū)?shù)圖的▲Rn不超過1且在低水平徘徊，則無擴增。
? 原因分析及解決方案：
可能是引物降解帶來的影響。當引物儲存不當時會導致引物降解并失去特異性，進而降低擴增效率?？赏ㄟ^核酸電泳的方式檢測引物的完整性，若原先的特異性條帶變成彌散帶，則表示引物發(fā)生降解。針對引物保存，需考慮以下四個建議：
a、引物凍干粉在長時間儲存和儲存溫度上有著更強的靈活性和保障；
b、引物濃度對穩(wěn)定性也會產(chǎn)生影響，不建議以低于10μM的濃度儲存引物，在大多數(shù)情況下，100μM的引物使用更加靈活容易；
c、引物探針也需和RNA一樣分裝儲存，以盡可能減少反復凍融帶來的影響；
d、TE緩沖液的儲存環(huán)境比水更加穩(wěn)定。
可能是模板濃度太低造成檢測困難。建議減少cDNA稀釋濃度重復實驗即可，通常情況下，未知濃度的樣品先從原液開始測。
可能是模板降解。這種情況下，需要重新制備RNA模板或cDNA模板，重新實驗。
? 原因分析：
在對數(shù)圖擴增曲線中，若基線期為連續(xù)曲線，則有可能是基線期設置循環(huán)周期偏少造成。
? 解決方案：
可以在設置中增大基線的終點值，調(diào)整后可恢復正常，如下圖所示：
? 原因分析：
在對數(shù)圖擴增曲線中，若擴增曲線基線期連續(xù)且后續(xù)出現(xiàn)明顯分段現(xiàn)象，則有可能是基線期設置循環(huán)周期偏多造成。
? 解決方案：
可以在設置中減小基線的終點值，調(diào)整后可恢復正常，如下圖所示：
? 原因分析及解決方案：
少數(shù)情況下，PCR反應管可能沒有蓋緊，當儀器進行熱循環(huán)時，反應液出現(xiàn)揮發(fā)、泄露。在上機前，建議用潔凈的手套或鑷子壓緊管蓋以避免該風險。
少數(shù)情況下，PCR反應液在管中可能出現(xiàn)掛壁，在反應進行時由于重力因素反應液下滑或最終進入反應體系。在上機前，建議使用桌面小離心機對PCR管進行離心，肉眼觀察無反應液掛壁，上機過程小心為上，減少抖動和碰撞發(fā)生。
多數(shù)情況下，可能是體系中抑制物較多，導致熒光不穩(wěn)定。當RNA提取樣本充裕的情況下，建議重新提取高純度RNA進行反轉(zhuǎn)錄、熒光定量。當RNA提取樣本缺失或稀少的情況下，建議稀釋cDNA后重新上機，減少抑制物的抑制作用。
多數(shù)情況下，可能是儀器開機后長時間運行，使用過度，導致熒光收集不穩(wěn)定。建議讓儀器待機/關(guān)機一段時間后，重新開啟運行。
? 原因分析及解決方案：
平臺期對Ct值影響不大。計算Ct值時，是通過閾值線(上圖綠色水平線)與擴增曲線指數(shù)期的交叉點進行的，故平臺期對于Ct值的影響不大。
無法到達平臺期可能是因為循環(huán)數(shù)設置太少，增加循環(huán)數(shù)可有助于觀察到明顯的平臺期。
當試劑擴增效率比較低時，酶活力不持久，下降較快，平臺期也可能會出現(xiàn)不明顯的現(xiàn)象?？赏ㄟ^增加鎂離子濃度或更換效力更強的酶解決該問題。
? 原因分析及解決方案：
可能是基線選取的范圍不正確，其中的基線終點大于曲線對應的Ct值。當模板DNA投入過多時(投入高濃度cDNA原液或cDNA上樣比例＞20%)，基線范圍仍取為3-15，其中會包含部分擴增信號，從而導致閾值線過高，對應的平臺期在計算時會出現(xiàn)下滑現(xiàn)象。這種情況下，可減少基線期終點，重新分析數(shù)據(jù)。
? 原因分析及解決方案：
若目的基因在樣品中的豐度較低，則可能出現(xiàn)Ct值偏大的現(xiàn)象。該情況下可選擇增加反轉(zhuǎn)錄時RNA的投入量或者減少cDNA的稀釋倍數(shù)可調(diào)整對應的Ct值。當RNA投入量是原先的2倍時，Ct值對應可減少1(21=2);當cDNA稀釋倍數(shù)由8倍調(diào)整為2倍時，Ct值對應可減少2(22=4)。
設計的目的片段過長，僅部分目的片段在每個循環(huán)中擴增，從而導致Ct值偏大。建議將目的擴增片段長度設計為80-200bp之內(nèi)，不建議超過300bp。
體系中可能存在抑制劑，導致擴增效率下降，最終使得Ct值偏大。建議減少投入的模板量或重新制備純度更高的RNA。
? 原因分析及解決方案：
可能是加樣誤差大導致的重復性差。儀器方面，需要每年對移液槍進行一次校正。在操作方面，采取先加大體積后加小體積液體的方式。移液器使用時采取二檔吸液一檔出液的方式，若下一次移液不更換槍頭，則第二槍開始一檔吸液一檔出液。
試劑或預混體系沒有徹底混勻，也會導致重復性偏差。建議在分裝反應液前，先將反應液以震蕩或吹打的形式進行充分混勻。上機之前，將PCR管離心，使得所有的液體都在反應管底部。
儀器未使用ROX校正，則也可能發(fā)生重復性偏差的現(xiàn)象。最好選用ROX校正。當所用試劑不含ROX時或ROX添加濃度不合適時，將ROX校正關(guān)閉。
當基因本身豐度低或模板濃度低時，Ct值會在30以上，同時Ct值重復性差。該情況下，建議將復孔數(shù)增加至4-6個，從中適當舍棄1-2個偏差較大的數(shù)據(jù)。
還有一種是邊緣效應，即邊緣孔與中心孔的擴增效率不一致，導致熒光信號采集偏差，影響定量結(jié)果的準確性。后續(xù)實驗中建議標準品和樣本盡量放在中心孔，邊緣孔加無模板對照（NTC）或不加入反應體系。
? 原因分析及解決方案：
可能是ROX濃度與機型不能匹配造成這種現(xiàn)象。建議在設置中找到Passive Reference后將ROX改為None，重新分析即可獲取正常的擴增曲線，如下圖所示。
? 原因分析及解決方案：
可能存在大小相近的非特異擴增，可以通過兩種方法進行判斷，簡單的方式是觀察起峰到落峰的溫度跨度，若跨度不大于7℃，則可視為單峰。另外相對復雜的方法是將產(chǎn)物進行高濃度瓊脂糖電泳(如3%瓊脂糖)進行輔助判斷。
? 原因分析及解決方案：
引物二聚體在引物對之間存在部分序列同源性時會形成，其長度通常會低于80bp，在70℃范圍區(qū)間會形成低熒光且更寬的波峰。具體的波峰大小會根據(jù)引物二聚體的大小和GC含量而發(fā)生變化。進行熒光定量之前，檢查引物二聚體的方法有多種，最好的可視化方法是進行核酸電泳，形成的引物二聚體通常會在凝膠底部附近顯示為彌散帶。減少引物二聚體的方法如下：
優(yōu)化熱循環(huán)條件，主要是提高退火溫度；
降低引物濃度。在多數(shù)情況下，引物終濃度為200 nM，可選擇降低至60 nM；
第一次針對一個靶標設計引物時，可嘗試設計三對引物組，選用其中效率最高、特異性表現(xiàn)最好的引物進行實驗。
? 原因分析及解決方案：
可能是cDNA樣本中存在gDNA污染，引物設計時未跨內(nèi)含子造成的其他擴增產(chǎn)物。建議設計引物時跨內(nèi)含子且不在單一外顯子模塊中設計，或在RNA提取時，選用帶gDNA去除的RNA提取試劑盒，或是在反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA時，選用帶gDNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑。
可能是引物特異性過差導致的非特異擴增。建議將引物序列輸入至NCBI中進行特異性分析，檢測在同物種中是否存在其他配對序列。
NTC：又稱為無模板對照，指除DNA或cDNA樣品以外的所有反應組分。在這些對照中檢測到的擴增通常是由于引物二聚體或擴增的PCR產(chǎn)物污染造成。這兩類污染會導致相關(guān)靶標的表達水平被人為的升高。
NTC對應Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃
? 原因分析及解決方案：
引物二聚體導致的非特異擴增，具體解決方案可見上述【熔解曲線為雙峰且較低峰Tm在80℃之前】。其中值得注意的點是，若實驗組和陰性對照組之間的Ct值差值遠大于10，則表示引物二聚體對于靶標片段擴增的影響不大，數(shù)據(jù)可用于分析。
NTC對應Ct值＜35，NTC熔解曲線與基因熔解曲線峰形重疊。
? 原因分析及解決方案：
這種情況下，多是由于體系中出現(xiàn)污染，例如水中、引物中、試劑中出現(xiàn)對應的模板，多為槍頭未更換帶來的交叉污染。該情況下，需要以控制變量的方式逐步排查污染源。
? 原因分析及解決方案：
可能是反應體系中出現(xiàn)污染，建議結(jié)合陰性對照結(jié)果確認污染情況，從水、引物、酶和環(huán)境等注意排除污染。
可能是熒光定量試劑暴露在強光或者高溫下導致試劑失效進而導致該問題出現(xiàn)，建議用新的熒光定量試劑進行對比試驗。
耗材與儀器不匹配，不能滿足熒光定量儀器光源對于耗材的需求。這種情況下，需確認儀器所對應的耗材要求，選擇正確且質(zhì)量有保證的耗材進行重復試驗。
儀器長時間未校正也可能會引發(fā)該情況。儀器方面建議每一年校正，以保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。
? 原因分析及解決方案：
可能是ROX濃度與機型不能匹配造成這種現(xiàn)象。建議在設置中找到Passive Reference后將ROX改為None，重新分析即可獲取正常的熔解曲線，如下圖所示。
高靈敏顯色示蹤熒光定量預混液
Hieff UNICON? ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix(No/Low/High ROX)
移液追蹤：降低漏加/錯加風險
擴增優(yōu)異：在寬廣的線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系
精準度好：可精準區(qū)分2倍濃度差異模板
重復性好：復孔孔間差異小，有更好的重復性
穩(wěn)定可靠：反應體系可于常溫放置24小時，產(chǎn)品反復凍融20次不影響
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
高靈敏顯色示蹤熒光定量預混液 | Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11188ES08 | 5×1 mL |
Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11189ES08 | 5×1 mL | |
Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11190ES08 | 5×1 mL |
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翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)和規(guī)模化生產(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉(zhuǎn)錄、抗體、蛋白純化及分析、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、報告基因檢測和類器官等多種系列，廣泛應用于生命科學研究、診斷檢測和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
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