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2025-01-10 17:02:33多色發(fā)光材料
多色發(fā)光材料是一種能夠發(fā)出多種顏色光的先進材料。這種材料通過特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計和發(fā)光機制,可以在不同激發(fā)條件下展現(xiàn)出豐富的色彩。多色發(fā)光材料在顯示技術(shù)、照明設(shè)備、光學(xué)傳感器等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。例如,它們可用于制造高色彩飽和度的顯示屏、可調(diào)節(jié)色溫的LED照明,以及用于生物標(biāo)記和傳感的高靈敏度探針。這些材料的發(fā)展為現(xiàn)代光學(xué)和光電子技術(shù)的創(chuàng)新提供了重要支持。

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2022-12-30 11:24:37MICA實現(xiàn)Caspase 3/7多色檢測
Caspases與細(xì)胞凋亡過程相關(guān),因此可以利用caspase檢測來確定細(xì)胞是否正在經(jīng)歷這種程序化的細(xì)胞死亡。這些檢測可以通過例如流式細(xì)胞儀、平板讀數(shù)儀實現(xiàn),也可以在顯微鏡上完成,顯微鏡可為量化數(shù)據(jù)補充可見的結(jié)構(gòu)信息。在這篇文章中,我們描述了MICA是如何用于caspase 3/7測定。借助Navigator或像素分類器等工具,MICA讓設(shè)置、執(zhí)行和分析caspase 3/7檢測變得更加容易,即使沒有經(jīng)驗的用戶也可輕松操作。圖像:雙色caspase檢測并進行拼接掃描。U2OS細(xì)胞用核標(biāo)記物DRAQ5(品紅)和CellEvent?(黃色)標(biāo)記。加入4mM星形孢菌素以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。20倍物鏡下使用雙通道熒光,持續(xù)16小時每30分鐘獲取一次2x2 FOV(視野范圍)的掃描拼接圖像。 引 言 凋亡細(xì)胞檢測或者活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測一般通過將某種物質(zhì)應(yīng)用于活細(xì)胞并觀察細(xì)胞反應(yīng),以此檢測其毒性或有效性。死亡率隨時間推移而上升或者劑量依賴性上升均證明物質(zhì)有效。判斷潛在藥物的抗 癌效果便是一個典型示例。商用染料試劑盒可檢測處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞。這些試劑盒內(nèi)染料為熒光染料,能夠分別標(biāo)記活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。Caspase活性檢測法是細(xì)胞凋亡檢測法的一種。Caspase(半胱天冬酶)是參與細(xì)胞凋亡過程的一類半胱氨酸蛋白水解酶。它們還用于區(qū)分caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死。這里的染料試劑盒使用的是DNA結(jié)合試劑,該試劑的熒光能夠被四氨基酸肽(DEVD)阻斷。一旦caspase-3和caspase-7(caspase-3/7)被激活,即當(dāng)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)時,caspase-3和caspase-7便會切割DEVD肽,然后DNA結(jié)合試劑便會開始呈現(xiàn)熒光。挑 戰(zhàn) 由于添加劑濃度不同、孵育時間不同、染色類型或者細(xì)胞系等參數(shù)的不同,實驗通常在多孔板上進行。這種方法有兩個優(yōu)點,一是能夠在一個反應(yīng)容器中設(shè)置多個不同的試驗條件,二是只需要極少量的試劑和極低數(shù)量的細(xì)胞。但是,在實施過程中,用戶仍然可能會被不同孔和不同實驗的數(shù)量混淆。設(shè)置多孔板實驗時,MICA自帶的Navigator工具能夠幫助預(yù)覽。包括可以在虛擬畫板上計劃并設(shè)置每一孔的掃描拼接實驗或者延時實驗(見圖1)。圖1:導(dǎo)航工具。Navigator能提供整個樣品載體的預(yù)覽(例如,玻片、培養(yǎng)皿、孔板),并幫助用戶設(shè)置實驗。用戶能夠在整個孔板上操作導(dǎo)航并進入單孔內(nèi),比如界定感興趣區(qū)域或者設(shè)計掃描拼接。追蹤細(xì)胞活動需要使單一熒光通道的時空相關(guān)性成像。傳統(tǒng)的寬場顯微鏡一般一次記錄一個通道,因此每一個細(xì)胞結(jié)構(gòu)只能按順序、一個接一個地記錄下來。這意味著兩個不同的結(jié)構(gòu)記錄于兩個不同的時間點。這對于極速發(fā)生的細(xì)胞事件來說可能會產(chǎn)生影響,特別是在共定位研究中。同時成像通過在同一時間記錄全部熒光的方法規(guī)避了這一缺點。對于caspase活性檢測法而言,這意味著用戶能夠觀察到,例如在caspase-3/7被激活的瞬間線粒體的反應(yīng)。MICA能夠同時檢測四種熒光,使用戶可以同時觀察到除細(xì)胞核、caspase-3/7活性、線粒體等之外的另一個細(xì)胞結(jié)構(gòu)(見圖5)。最 后,如果想要確定某一特定試劑在誘導(dǎo)caspase介導(dǎo)細(xì)胞凋亡時的效果,則需要對caspase檢測進行量化。這種量化需要通過專門的外部軟件來實現(xiàn)。MICA自帶分析解決方案,不需要另外的軟件。通過MICA自帶的像素分類器,用戶能夠標(biāo)記一些感興趣區(qū)域(ROI),人工智能算法可以訓(xùn)練和識別這些區(qū)域(見圖2)。對于caspase活性檢測法而言,細(xì)胞核信號可用于確定細(xì)胞總數(shù)。CellEvent?信號可用于識別caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞。圖2:利用像素分類工具訓(xùn)練MICA識別圖像中樣品特征。通過在圖像中標(biāo)記示例特征,像素分類器能夠訓(xùn)練和劃分所有目標(biāo)物。 方 法 在這一案例研究中, U2OS細(xì)胞或者COS7細(xì)胞被鋪在96孔板,然后培養(yǎng)一整晚的時間。在實驗過程中,活細(xì)胞分別用DRAQ5、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分鐘。之后,更換培養(yǎng)基,在實驗結(jié)束前使用CellEvent?孵育細(xì)胞。每孔內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素(3 μM–7 μM)。在四色caspase活性檢測法中,U2OS細(xì)胞被接種在96孔板上并在夜間生長,然后培養(yǎng)一整晚的時間。在實驗過程中,活細(xì)胞與DAPI和TMRE孵育45分鐘。之后,更換培養(yǎng)基,在實驗結(jié)束前使用CellEvent?和SiR-Tubulin孵育細(xì)胞。每孔內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)劑—星形孢菌素(3 μM–7 μM)。在37℃、5% CO2和~65%濕度的環(huán)境中,按照指示的時間間隔和持續(xù)時間用MICA進行活細(xì)胞成像。使用Navigator工具設(shè)定并執(zhí)行檢測。一些實驗中會運行掃描拼接(參見視頻2)。進行掃描拼接時,研究人員使用的主要策略是“focus Map”;此外,延時實驗通過“Keep focus”來保持細(xì)胞的聚焦。使用MICA自帶的分析功能進行本次實驗中的數(shù)據(jù)分析。其中核心組件之一便是人工智能驅(qū)動的像素分類器,該功能位于“Learn”選項。通過像素分類器,用戶能夠標(biāo)記其感興趣區(qū)域(ROI),該區(qū)域?qū)⒆鳛樗幸獧z測的其他區(qū)域的示例。如圖5所示,細(xì)胞核被像素分類器標(biāo)記并檢測。像素分類器同樣能夠標(biāo)記并檢測線粒體活性標(biāo)識TMRE和caspase呈陽性的細(xì)胞。之后會在整個延時攝影過程中分析這批圖像。經(jīng)過計算之后,MICA會將計算結(jié)果以散點圖、共定位圖、直方圖、餅狀圖、框圖或者時間序列圖的形式展示在“結(jié)果”選項中。圖3:在分析過程中,MICA會標(biāo)記作為樣例的感興趣區(qū)域,為人工智能驅(qū)動的分析功能提供信息。在此檢測法中,細(xì)胞核(品紅)和caspase陽性細(xì)胞(綠色)會被用于訓(xùn)練像素分類器,通過這種方式,像素處理器便有能力分析caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞比例。 結(jié) 果 SPY-650-DNA(標(biāo)記細(xì)胞核)和CellEvent?(標(biāo)記caspase 3/7活性)兩種細(xì)胞染料的量化研究揭示了在活細(xì)胞實驗中發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞。細(xì)胞核的數(shù)量說明了每張圖像中細(xì)胞的數(shù)量,可與處于凋亡過程中細(xì)胞的數(shù)量相對應(yīng)。另一個標(biāo)記,即TMRE成像過程,揭示了線粒體活性。量化數(shù)據(jù)(如長度、寬度、面積)顯示在采集圖像下方的表格中,這些數(shù)據(jù)可被導(dǎo)出為Excel表格。獲取的圖像可以在延時成像的每一個時間點上查看,并可以與識別的ROI重疊。三色caspase 3/7活性檢測圖(圖4)顯示,細(xì)胞核信號在開始的時候增強,之后逐漸減弱。信號增強是因為核染色劑必須與DNA結(jié)合,這一結(jié)合過程需要一定的時間。另一方面,SPY-650-DNA信號減弱是因為細(xì)胞核解體,解體現(xiàn)象見相關(guān)圖像。其他信號要么隨時間增加而增強(CellEvent?),要么隨時間增加而減弱(TMRE):caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加的同時激活狀態(tài)的線粒體數(shù)量減少。圖4:三色caspase 3/7活性檢測法量化研究。通過像素分類器檢測細(xì)胞核、TMRE和caspase陽性細(xì)胞,以確定在不同濃度的星形孢菌素下,隨著時間的推移發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡的細(xì)胞數(shù)量。TMRE信號能反映線粒體的健康狀態(tài)。結(jié)果可以多種形式展示,比如時間序列圖。用戶可以通過MICA一次性對四種熒光成像。在caspase 3/7活性檢測法中,這有助于調(diào)查凋亡過程中額外的細(xì)胞成分的命運—實現(xiàn)100%時空相關(guān)性。圖5中展示的案例顯示,除了細(xì)胞核(DAPI)、激活狀態(tài)的線粒體(TMRE)以及caspase陽性細(xì)胞(CellEvent?)以外,也對肌動蛋白細(xì)胞骨架(SiR-Actin)進行了染色。高倍率下(63x),用戶能夠看到,caspase被激活之后,肌動蛋白細(xì)胞骨架坍塌。與此同時細(xì)胞核以及線粒體停止工作。因為所有通道都是在一次拍攝中獲得的,各細(xì)胞活動成像之間存在精確聯(lián)系。圖5:四色caspase-3/7檢測,用SiR-Actin、TMRE(線粒體活性)、CellEvent?(caspase活性)以及DAPI(細(xì)胞核)標(biāo)記U2OS細(xì)胞。在時間點0加入星形孢菌素。在63x高倍、寬場模式以及THUNDER(ICC)成像模式下獲得的圖像。結(jié) 論Caspase活性檢測法為研究抗 癌藥物提供了新的見解。為了實現(xiàn)這一目標(biāo),研究人員必須在保證高時空精 準(zhǔn)度的情況下將活細(xì)胞從凋亡細(xì)胞中區(qū)分出來。對于統(tǒng)計上可靠的結(jié)果,增加量很有必要。這就是為什么這類實驗必須在孔板上進行,也必須進行量化研究。MICA滿足以上全部要求。在FluoSync的幫助下,MICA可同時保證多達4種不同的熒光染料可以同時成像,不論是在單一培養(yǎng)皿上,還是在96孔板上。MICA完整的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠培育活細(xì)胞數(shù)日,同時其自帶的基于人工智能的分析功能也有助于用戶獲得可靠的數(shù)據(jù)。參考:FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images, Science Lab, Leica Microsystems (leica-microsystems.com)
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