Liberty PRIME? 2.0 微波肽合成器是目前蕞先進(jìn)的肽合成系統(tǒng)。它基于一鍋法偶聯(lián)脫保護(hù)的固相肽合成新方法，大大減少了循環(huán)時(shí)間和廢液，達(dá)到前所未有的水平。該系統(tǒng)完成一個(gè)循環(huán)時(shí)間僅為 2 分鐘 10 秒（適用于所有 20 種標(biāo)準(zhǔn) Fmoc 氨基酸），僅產(chǎn)生 8mL 化學(xué)廢物，是 CEM 高效 Liberty Blue 2.0 肽合合器的一半。Liberty PRIME 2.0 HT 24 是高通量合成標(biāo)準(zhǔn)多肽和復(fù)雜多肽的理想系統(tǒng)，能夠在一天內(nèi)自動(dòng)合成多達(dá) 24 個(gè)肽。

介 紹

傳統(tǒng)多肽固相合成包括重復(fù)地分別完成脫保護(hù)和偶聯(lián)步驟，中間需要清洗?；谶@樣的假設(shè)，如果沒有完全清洗和排除上一步的廢液，將會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的氨基酸插入。2013年我們的研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)，省略偶聯(lián)步驟后的清洗，不會(huì)影響多肽純度 1。Liberty PRIME 使用了如圖 1 2 所示的一鍋偶聯(lián)和脫保護(hù)的新工藝實(shí)現(xiàn)了省略偶聯(lián)后清洗步驟。該技術(shù)涉及將脫保護(hù)試劑（堿）直接添加到偶聯(lián)后混合物中。這基于以下原理，溶液中酯鍵更高的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)能級(jí)，促使其快速水解或自縮合，從而避免樹脂上氨基官能團(tuán)的潛在副反應(yīng)。然后在高溫下不間斷地進(jìn)行 Fmoc 去除。試劑的優(yōu)化使用使接近脫保護(hù)步驟結(jié)束時(shí)，反應(yīng)混合物為中性。這種新程序具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.脫保護(hù)步驟的溶劑需求減少約 90%；2.脫保護(hù)后洗滌的溶劑需求減少 75%；3.更快的脫保護(hù)步驟，因?yàn)槲⒉ú恍枰獣r(shí)間緩慢下降；4.由于沒有后偶聯(lián)排放步驟，循環(huán)時(shí)間更短。

圖1. Liberty PRIME 2.0 使用的一鍋偶聯(lián)/脫保護(hù)

使用一鍋偶聯(lián)/脫保護(hù)方法需要能夠持續(xù)添加精確的小體積濃縮堿。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，Liberty PRIME 2.0 采用了專用泵送模塊，能夠在偶聯(lián)步驟結(jié)束時(shí)以低至 0.25mL 的體積快速添加脫保護(hù)試劑。預(yù)先校準(zhǔn)的泵模塊不需要持續(xù)校準(zhǔn)，從而避免了輸送量的漂移。

此外， 主要清洗劑和激活劑 (Oxyma Pure) 也通過模塊內(nèi)類似的單獨(dú)的泵輸送，以提高儀器性能。

圖2. PRIME 2.0上使用的集成泵模塊

Liberty PRIME 2.0 還使用了 CarboMAX? 偶聯(lián)工藝，通過使用相對(duì)于氨基酸的更高比例的碳二亞胺（2倍當(dāng)量）3，在高溫下改進(jìn)現(xiàn)有的碳二亞胺化學(xué)反應(yīng)。這種偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)已被證明能使O-酰基異脲中間體更快形成，從而加快偶聯(lián)速率，同時(shí)相應(yīng)地減少差向異構(gòu)化 4。Liberty PRIME 2.0 在 105℃ 下使用 CarboMAX 偶聯(lián)工藝的高效 1 分鐘偶聯(lián)為所有 20 種標(biāo)準(zhǔn) Fmoc 氨基酸（包括半胱氨酸和組氨酸）提供了出色的連接率和Z低的差向異構(gòu)化率。

Liberty PRIME 自動(dòng)微波肽合成儀完成了一系列眾所周知的困難多肽合成，顯示了其優(yōu)秀的性能。注意：所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系統(tǒng)上合成。

材料和方法

試 劑

所有Fmoc氨基酸均購(gòu)自CEM公司（Matthews ,NC）,并包含以下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Boc), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) and Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和Rink Amide ProTide^? LL 樹脂也購(gòu)自CEM公司。Rink Amide MBHA LL 和Fmoc-Gly-wang LL樹脂購(gòu)自MilliporeSigma 公司（Burlington, MA）。N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、吡咯烷、三氟乙酸(TFA)、3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三異丙基硅烷(TIS) 和乙酸購(gòu)自Sigma-Aldrich (St. Louis, 莫）。二氯甲烷(DCM)、N,N 二甲基甲酰胺(DMF) 和無水乙酉迷(Et₂O) 購(gòu)自VWR (West Chester, PA)。HPLC 級(jí)水(H₂O) 和HPLC 級(jí)乙腈(MeCN) 購(gòu)自Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成

所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系統(tǒng) (CEM Corp.) 上以 0.10mmol 規(guī)模合成，使用 CarboMAX 偶聯(lián)和 一鍋法偶聯(lián)/脫保護(hù)法。在 DMF 中與 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma （5/10/5）在 105 °C 下偶聯(lián) 60 秒。通過直接添加 0.5 mL 的 25% 吡咯烷/DMF到偶聯(lián)后混合溶液中，開始脫保護(hù)步驟，并在排液前在 100 °C 下再繼續(xù)反應(yīng) 40 秒。隨后進(jìn)行一次 4 mL 洗滌。使用帶有 TFA/ H₂O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統(tǒng)在 40°C 下進(jìn)行切割 30 分鐘。切割后肽在冷乙酉迷中沉淀并凍干過夜。

多肽分析

在配備有 PDA 檢測(cè)器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上分析未經(jīng)任何純化的粗肽，該檢測(cè)器配備 Acquity UPLC BEH C8 色譜柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。在 Waters MassLynx 軟件上進(jìn)行峰分析。使用 (i) H₂O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進(jìn)行分離。

結(jié) 果

與 CEM 的 Liberty Blue 自動(dòng)化微波肽合成儀上使用的標(biāo)準(zhǔn)方法相比，Liberty PRIME 上的一鍋法偶聯(lián)/脫保護(hù)工藝生產(chǎn)出高純度肽，循環(huán)時(shí)間減少約 50%，化學(xué)廢物總量減少 66% 。Liberty PRIME 上 0.10 mmol 規(guī)模的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)在脫保護(hù)和隨后的偶聯(lián)之間使用 4mL 的單次洗滌，僅產(chǎn)生 8mL 化學(xué)廢物，總循環(huán)時(shí)間為 2 分 10 秒。表 1 顯示了在 Liberty PRIME 上合成的一組八種肽的粗純度、總合成時(shí)間和總化學(xué)廢物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1. Liberty PRIME上的多肽合

圖3. UPLC-MS Analysis of crude 65-74ACP.

圖4. UPLC-MS Analysis of crude ABC-20 mer.

圖5. UPLC-MS Analysis of crude JR-10 mer.

圖6. UPLC-MS Analysis of crude Exenatide.

圖7. UPLC-MS Analysis of crude 7-37GLP1.

圖8. UPLC-MS Analysis of crude PNIA(A10L).

圖9. UPLC-MS Analysis of crude Parigidin-br-1.

然后研究了 Liberty PRIME 上使用的高溫偶聯(lián)方法潛在的差向異構(gòu)化。特別是已知在偶聯(lián)過程中對(duì)差向異構(gòu)化敏感的半胱氨酸和組氨酸。差向異構(gòu)化水平通過包括水解、隨后衍生化和氣相色譜分析（C.A.T. GmbH）等眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行研究。如表 2 所示，發(fā)現(xiàn)在室溫下使用 HBTU/DIEA 活化方法觀察到的差向異構(gòu)化水平高于 90℃ 標(biāo)準(zhǔn)或 CarboMAX 偶聯(lián)以及 Liberty PRIME 上 105℃ CarboMAX 偶聯(lián)的差向異構(gòu)化水平。使用 Fmoc-His(Boc)OH 代替 Fmoc-His(Trt)-OH 允許 90℃ 或 105℃ 的偶聯(lián)溫度，而差向異構(gòu)化水平?jīng)]有任何增加。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了標(biāo)準(zhǔn)的 HE-SPPS 或 CarboMAX 偶聯(lián)方法特別適用于高溫下的肽合成。

表2. CarboMAX 偶聯(lián)方法的ABC-20mer 多肽中半胱氨酸和組氨酸的差向異構(gòu)化水平

aFmoc-His(Trt)-OH; bFmoc-His(Boc)-OH; cFmoc-Cys(Trt)-OH.

結(jié) 論

Liberty PRIME 自動(dòng)微波肽合成儀上使用的一鍋偶聯(lián)/脫保護(hù)方法能非常有效地合成各種肽。對(duì)所有 20 種氨基酸（包括半胱氨酸和組氨酸）使用了改進(jìn)的 CarboMAX 偶聯(lián)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)，極大簡(jiǎn)化了序列優(yōu)化需求。Liberty PRIME 2.0 的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)時(shí)間為 2 分鐘，是標(biāo)準(zhǔn)肽和復(fù)雜肽高通量合成的理想選擇，并且可以空前地減少?gòu)U棄物產(chǎn)生。