親水復(fù)合物I結(jié)構(gòu)域和VDAC1的NDUFV2和NDUFS4亞基的低豐度預(yù)示著哺乳動(dòng)物的長(zhǎng)壽

影響因子：9.986

期刊：氧化還原生物學(xué)

單位： 歐洲FEDER基金

研究背景

?Cx I的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)含量存在物種特異性差異。

?長(zhǎng)壽表型的實(shí)現(xiàn)與來(lái)自Cx I基質(zhì)親水域的亞基NDUFV2和NDUFS4的低蛋白豐度有關(guān)。

?長(zhǎng)壽哺乳動(dòng)物的VDAC（電壓依賴性陰離子通道）量也較低。

?這些差異可能與長(zhǎng)壽動(dòng)物的衰老率有關(guān)。

研究目的

線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生，特別是在復(fù)合物I（Cx I）上，已被廣泛認(rèn)為是決定物種壽命的決定因素之一。本研究采用一種比較方法來(lái)分析壽命從3.5至46年的8種哺乳動(dòng)物的心臟組織中的復(fù)雜I。分別使用液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和蛋白質(zhì)印跡分析所選Cx I亞基的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)含量。以此來(lái)調(diào)查豐富的Cx I親水域選擇的亞基和VDAC可能與長(zhǎng)壽命哺乳動(dòng)物物種的mitROSp低有關(guān)

研究方法

我們使用液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和蛋白質(zhì)印跡方法來(lái)定義八個(gè)哺乳動(dòng)物物種心臟組織中線粒體電子運(yùn)輸鏈Cx I亞基和VDAC的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)態(tài)水平壽命的差異，從老鼠的3.5歲到馬的46歲。

基因表達(dá)：液滴數(shù)字PCR  

事先進(jìn)行DNA擴(kuò)增，使用RNeasy纖維組織迷你試劑盒（德國(guó)蓋爾根，Qiagen）提取來(lái)自15 mg整個(gè)心臟組織的RNA，并使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)加利福尼亞州Applied Biosystems）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。。

對(duì)于DNAJD定量（份數(shù)/μl），反應(yīng)混合物中含有1x EvaGreen ddPCR Supermix，200 nM引物和0.01–16 ng模板cDNA。為了產(chǎn)生液滴，將20μL反應(yīng)混合物和70μL用于EvaGreen的液滴產(chǎn)生油裝入液滴生成芯片中，然后將其放入液滴生成儀中。從每種PCR反應(yīng)混合物中，將20μL轉(zhuǎn)移到96孔PCR板中，并使用PCR板封膜儀用箔加熱將其密封。在Z初的DNA聚合酶激活（95°C，5分鐘）和40個(gè)循環(huán)（由DNA變性（95°C，30 s），引物退火（58°C，1分鐘）之后，在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增）和延伸（60°C，1分鐘）。包括ZH的染料穩(wěn)定化步驟（4°C 5分鐘和90°C 5分鐘）。用微滴讀取儀讀取液滴，并使用軟件進(jìn)行分析。

研究進(jìn)展

1●多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示特定物種的Cx I譜

應(yīng)用多變量統(tǒng)計(jì)確定哺乳動(dòng)物中特定的Cx I亞基基因表達(dá)（ndufv2，ndufs3，ndufs4和ndufs5）和蛋白質(zhì)含量（NDUFV2，NDUFS3，NDUFS4和NDUFA9）是否不同。非監(jiān)督主成分分析（PCA）顯示了Cx I的物種特異性基因和蛋白質(zhì)譜的存在，能夠解釋高達(dá)65.4％的樣品變異性（圖1 A）。用熱圖表示的樣本的層次聚類揭示了嚙齒動(dòng)物（小鼠，大鼠和豚鼠）和非嚙齒動(dòng)物（兔子，豬，牛和馬）的特定Cx I模式（圖1 B和C）。通過(guò)執(zhí)行監(jiān)督分析，例如偏Z小二乘判別分析（PLS-DA）（圖1 D），可以證實(shí)這些結(jié)果。當(dāng)僅使用一種組分時(shí)，PLS-DA模型的交叉驗(yàn)證值得出的ZDQ 2為0.3，R 2為0.4（圖1 E）。置換測(cè)試（1000次重復(fù)）得出的p = 0.02，表明置換數(shù)據(jù)形成的分布均未比基于原始數(shù)據(jù)的觀察到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)更好（圖1 F）。通過(guò)可變重要性投影（VIP）分?jǐn)?shù)> 1.5評(píng)估不同測(cè)量特征的組間區(qū)分能力，該分?jǐn)?shù)僅針對(duì)NDUFV2獲得（圖1 G）。這些結(jié)果得到了應(yīng)用隨機(jī)森林（RF）分類算法的支持，該算法揭示出物種總體分類誤差為0.26（圖1 H和I）。

2●VDAC含量與動(dòng)物壽命有關(guān)

VDAC是線粒體通透性過(guò)渡孔（mPTP）的組成部分，通常用作線粒體蛋白的上樣對(duì)照。為了在比較不同動(dòng)物時(shí)檢查其適用性，我們通過(guò)執(zhí)行ANOVA分析比較了總VDAC含量。出乎意料的是，我們發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物物種之間的總VDAC含量會(huì)發(fā)生變化，并且與動(dòng)物壽命呈負(fù)相關(guān)（圖2A）。此外，VDAC總含量與NDUFV2和NDUFS4蛋白含量呈正相關(guān)（圖2B和C）。

研究結(jié)論

長(zhǎng)壽的哺乳動(dòng)物物種的復(fù)合物I親水域的NDUFV2和NDUFS4亞基水平較低，這可能部分歸因于其較低的mitROSp和較高的壽命。這些動(dòng)物較低的VDAC含量也可能由于較低的ROS介導(dǎo)的線粒體通透性過(guò)渡孔的開(kāi)放而有助于其長(zhǎng)壽。

文章總結(jié)

通過(guò)文章的研究發(fā)現(xiàn)，利用數(shù)字PCR技術(shù)可以JZ檢測(cè)VDAC1的NDUFV2和NDUFS4亞基的低豐度，以此來(lái)研究哺乳動(dòng)物長(zhǎng)壽的原因，廣東永諾YL科技有限公司自主研發(fā)的數(shù)字PCR檢測(cè)平臺(tái)，以其可靠的檢測(cè)性能，為動(dòng)物基因JZ研究提供可靠保障。

文獻(xiàn)原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231720303281?via%3Dihub