綠色熒光蛋白嵌合體小鼠的建立和鑒定 1 材料與方法 111 材料 11111 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系 ES2D3 細(xì)胞系, 昆明小鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ZX提供; 小鼠胚胎呈纖維細(xì)胞(MEF) 取自孕1215 d 昆明小鼠胚胎 11112 實(shí)驗(yàn)試劑 綠色熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP2N1 (N1 末端改進(jìn)型熒光蛋白載體) 為Clontech公司產(chǎn)品;Lipofectin轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自GBICO 公司, Bam H 限制性內(nèi)切酶試劑盒(目錄號(hào)MR0521)RNaseA購(gòu)自華美生物工程公司,DL15000Markers 試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;DMEM 培養(yǎng)基和L IF購(gòu)自GBICO公司胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司; 胰酶M16 M2 培養(yǎng)液購(gòu)自SIGMA 公司 112 方法 11211 ES2D32GFP 細(xì)胞的建立和培養(yǎng)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法用質(zhì)粒p EGFP2N1(N末端改進(jìn)型熒光蛋白載體Clontech 公司) 轉(zhuǎn)染ES2D3 細(xì)胞將10 l質(zhì)粒p EGFP2N1Lipofectin分別溶于100l 80l 無血清DMEM 培養(yǎng)基中, 混合后加入800l 無血清DMEM 培養(yǎng)基混勻, 滴加至ES2D3 細(xì)胞上, 加入轉(zhuǎn)染液后于375%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)5 h 棄轉(zhuǎn)染液, 換ES 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)液為葡萄糖含量4 500 mg/ L 的DMEM 添加20%FBS2巰基乙醇011 mmol/ L L IF 1 000 IU/ ml青霉素100IU/ ml 鏈霉素100IU/ml) 48 h 后消化接種至經(jīng)MMC 處理過的MEF 上, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后, 用濃度為300g/ ml G418的ES細(xì)胞培養(yǎng)液篩選抗性克隆, 倒置熒光顯微鏡下挑取熒光Z強(qiáng)的克隆, 命名為ES2D32GFP 細(xì)胞, 進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng) 2 結(jié)果 熒光蛋白觀察鏡 熒光蛋白激發(fā)光源 熒光蛋白觀察鏡(無激發(fā)光源） 熒光蛋白觀察鏡 熒光蛋白濾光片