在分析科學(xué)中，實(shí)現(xiàn)生物分子的可靠色譜分離一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)?？茖W(xué)家通常采用親水相互作用色譜 (HILIC) 檢測(cè)和分離酸性代謝物（例如含有多個(gè)磷酸或羧酸基團(tuán)的代謝物）。在分析磷酸肽、磷酸化多糖、單克隆抗體和藥物化合時(shí)，各種固定相（包括反相、離子交換和體積排阻）普遍存在信號(hào)抑制與峰形不佳的情況。這些現(xiàn)象通常與色譜柱及系統(tǒng)硬件金屬表面的相互作用有關(guān)。

超高惰性技術(shù)的 Agilent Altura HPLC 柱是一款帶涂層的不銹鋼 (SS) 柱，其惰性涂層可阻止分析物與金屬表面的相互作用，同時(shí)仍保持了不銹鋼柱硬件的強(qiáng)度、穩(wěn)定及耐高壓優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)部分

 樣品

極性代謝物包括有機(jī)酸（即谷氨酰胺、谷氨酸和蘋果酸）

和磷酸化核苷酸（例如 AMP、ADP 和 ATP）

磷酸肽樣品（序列信息及磷酸化殘基位點(diǎn)詳見表 1

表 1. 本研究中使用的磷酸肽的序列。(pS) 表示磷酸化絲氨酸，(pY) 表示磷酸化酪氨酸

儀器和色譜柱：

色譜柱：

采用超高惰性技術(shù)的 Agilent Altura HILIC-Z 色譜柱， 2.1 × 150 mm, 2.7 μm （部件號(hào) 227215-924）

儀器和參數(shù)：

LC/MS 分析采用以下儀器配置：

Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A)

Agilent 1290 Infinity II Bio Multisampler，配備樣品恒溫箱 (G7137A)

Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B)

Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

表 2. HPLC 參數(shù)

表 3. 質(zhì)譜參數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

采用超高惰性技術(shù)的 Altura 色譜柱在三類代表性化合物的分析中始終優(yōu)于不銹鋼色譜柱。

Altura 色譜柱具有優(yōu)異惰性，可明顯減少分析物因?yàn)槲皆斐傻男盘?hào)損失。

圖 1. 不銹鋼 (SS) 和 Agilent Altura 超高惰性 HPLC 色譜柱在三類化合物中的色譜性能比較：合成肽、磷酸化核苷酸（AMP、ADP 和 ATP）和酸性代謝物（谷氨酰胺、谷氨酸和蘋果酸）。合成肽采用反相 (RP) 色譜分離，磷酸化核苷酸和酸性代謝物則采用親水相互作用色譜 (HILIC) 分離。

圖 2. 通過柱狀圖顯示，Altura 色譜柱的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度明顯更高，證明了出色的惰性和更高的分析物回收率

表 4. 采用惰性色譜柱硬件改善峰形。結(jié)果表明，金屬敏感性分析物的拖尾因子得到明顯改善。部分分析物因完全吸附無(wú)法獲得定量結(jié)果，未列入本表。多肽 “a” 和多肽 “c” 的序列參見表 1

結(jié)語(yǔ)

在所有測(cè)試的化合物類型中，采用超高惰性技術(shù)的 Altura 色譜柱產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度是傳統(tǒng)不銹鋼柱的 2 至 3 倍。此外，使用惰性柱硬件時(shí)拖尾因子降低，表明大多數(shù)目標(biāo)分析物的峰分離度得到顯著提高（表 4）。這些結(jié)果證明了硬件表面的化學(xué)性質(zhì)在實(shí)現(xiàn)可靠、高靈敏度分離方面的關(guān)鍵作用，對(duì)于容易與金屬發(fā)生相互作用的分析物更是如此。

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