目前，在常規(guī)色譜方法中，使用長度為 250mm 或 150mm、粒徑為 5μm 的色譜柱時(shí)，通常會(huì)遇到分離度稍有欠缺不能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求的問題。那么，在不改變原有色譜方法、保持色譜固定相相同或相近選擇性的情況下，能否還有方法改善分離度？

提高柱效是改善分離度的關(guān)鍵

分離度（Rs）的好壞，與色譜柱柱效(N)、選擇性（α）、保留因子（k）有關(guān), 見分離度公式。在保持相同的選擇性 α（流動(dòng)相條件、柱溫、固定相等）和相同色譜柱尺寸的條件下，提高柱效是改善分離度的關(guān)鍵。

分離度（Rs）公式：

提高柱效的方法：

?降低色譜填料顆粒的粒徑

?提高化合物在填料顆粒微孔中的傳質(zhì)效率

?使用顆粒粒度更加均勻的填料

如何提高柱效？是否會(huì)超出藥典規(guī)定范圍要求？

現(xiàn)行美國藥典 USP 通則 <621> 中對(duì)色譜柱尺寸變化的要求是：填充劑粒徑（dp）和柱長（L）的比例關(guān)系 L/dp 值或( N 值)應(yīng)在原有數(shù)值的 -25%~+50% 范圍內(nèi)。藥典色譜柱尺寸調(diào)整后方法參數(shù)允許調(diào)整的范圍也是 L/dp 值或( N 值)在 -25%~+50% 范圍內(nèi)。

分析實(shí)踐工作中，可以保持柱長(L)不變，通過降低粒徑(dp)的辦法，提升柱效，達(dá)到分離度改善的結(jié)果。以通用的 4.6*250mm 色譜柱為例，不同粒徑色譜的 L/dp 計(jì)算結(jié)果見表 1 。

表 1. 不同粒徑色譜柱 L/dp 值及壓力倍數(shù)計(jì)算結(jié)果

*備注：壓力倍數(shù)是以 5μm 粒徑色譜柱為基準(zhǔn)，根據(jù)壓力與粒徑的平方成反比的關(guān)系計(jì)算。

從表 1 結(jié)果可見，柱長和內(nèi)徑保持不變，使用 4μm 和 3.5μm 色譜柱時(shí)，都可以滿足 L/dp 值的變化在 -25% 到 +50% 范圍內(nèi)。不過，當(dāng)選擇更小粒徑色譜柱時(shí)，需要考慮壓力的問題。

從 5μm 到 4μm，柱效提高到 2 倍

通常表面多孔型填料能滿足上述對(duì)柱效提高的需求，更多內(nèi)容參考 Agilent 相關(guān)資料。Poroshell 4μm 粒徑色譜柱的柱效(N)相當(dāng)于相同尺寸全多孔 5μm 粒徑的兩倍，可以利用這一點(diǎn)來改善常規(guī)色譜方法的分離度。從分離度公式計(jì)算，在其它條件不變的情況下，兩倍柱效的提升可以提高到 1.4 倍的分離度（理論值）。這對(duì)現(xiàn)有方法分離度不佳或者限制于壓力問題不能使用更小粒徑（如3μm）色譜柱的應(yīng)用來說，1.4 倍分離度的貢獻(xiàn)是非常有用的。

圖 1. Agilent InfinityLab Poroshell 120 色譜柱

例如，某標(biāo)準(zhǔn)方法中，使用 Zobax SB-C18 4.6*250mm 5μm 色譜柱，關(guān)鍵組分的分離度只有 1.2。從分離度改善的角度，選擇了高效傳質(zhì)、填料顆粒大小均勻的 4μm Poroshell 120 SB-C18 色譜柱，所有色譜方法均不改變，其分離度達(dá)到了 1.5 以上。

目前，粒徑為 4μm 的 Poroshell 色譜柱包括：

?封端的 EC-C18、C8

?能耐低 pH、不封端的 SB-C18 柱

?能耐高 pH 體系的 HPH-C18 和 C8 柱

?特殊選擇性的苯基己基（Phenyl-Hexyl）、五氟苯基（PFP）、SB-Aq 以及用于強(qiáng)極性化合物分析的 HILIC 固定相（ HILIC 和 HILIC-Z）

尤其是最常用的 C18 柱，當(dāng)原方法使用 Zorbax SB-C18 或 Plus/XDB-C18 時(shí)，可以非常方便地轉(zhuǎn)換到對(duì)應(yīng)的 Poroshell 色譜柱上，而不需要對(duì)方法進(jìn)行調(diào)整。

實(shí)際應(yīng)用案例分享

應(yīng)用案例 1:

機(jī)動(dòng)車檢驗(yàn)標(biāo)志電子化

方法要求分離度 Rs>11.5。當(dāng)使用相同尺寸的 Poroshell 4μm 色譜柱時(shí)，柱效有將近一倍的提升，分離度提升 1.23 倍。在進(jìn)行溶出分析或者其它快速中控分析時(shí)，選擇這樣的色譜柱可以適當(dāng)減少柱長，達(dá)到快速分析的目的。如案例中使用 100mm 長的色譜柱，分離度和柱效依然滿足藥典要求。

圖 2. 萘普生片含量測定-USP 方法結(jié)果

應(yīng)用案例 2:

苯扎貝特有關(guān)物質(zhì)分析

方法中換成相同尺寸 Poroshell 4μm 色譜柱后，不僅分離度提升，而且柱效和靈敏度都有提升。

圖 3. 苯扎貝特有關(guān)物質(zhì)的檢測結(jié)果

應(yīng)用案例 3:

三七皂苷的分析

所用分析方法不變，僅將所用色譜柱改為4μm Poroshell色譜柱，Rg1和Re的分離度從1.51提高到了2.31。柱效更高、壓力適中的色譜柱，用于建立耐用的中藥成分含量測定方法非常實(shí)用。

圖 4. 三七皂苷的含量測定結(jié)果：Poroshell 120 4μm vs. 全多孔 5μm

應(yīng)用案例 4:

穿黃制劑定性指紋圖譜及多組分含量測定方法研究

該研究對(duì)流動(dòng)相、柱溫、色譜柱等進(jìn)行了選擇和優(yōu)化，最 后確定使用 Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 250 mm, 4 μm 色譜柱，無論指紋圖譜還是多組分含量測定都非常完 美。

圖 5. 17 批穿黃制劑指紋圖譜疊加圖：１－新綠原酸；２－綠原酸；３－隱綠原酸；４－異綠原酸Ｂ；５－異綠原酸Ａ；７－異綠原酸Ｃ；８－穿心蓮內(nèi)酯；９－新穿心蓮內(nèi)酯；１０－去氧穿心蓮內(nèi)酯；１１－脫水穿心蓮內(nèi)酯

圖 6. 穿黃制劑 HPLC 指紋圖譜共有模式

4μm Poroshell 120 的優(yōu)勢和應(yīng)用：

替代5μm全多孔色譜柱時(shí)，滿足藥典 L/dp 變化要求

與5μm全多孔填料相比，約有 1 倍柱效提升

提供多種固定相類型

200-400bar 的 HPLC 儀器都能用

含量測定、溶出、快速分析

化藥有關(guān)物質(zhì)檢查、中藥特征圖譜研究

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