產(chǎn)品名稱	EdU增殖檢測試劑盒（綠色熒光，適用爬片檢測）
貨號	SNK-013
規(guī)格	50T/200T
簡介	EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine），中文名為5-乙炔基-2'-脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖時期，能夠代替胸腺嘧啶（T）摻入正在復(fù)制的DNA分子中，EdU上的乙炔基能與熒光標記的小分子疊氮化物探針在一價銅離子催化下發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)（Click reaction），通過點擊反應(yīng)，新合成的DNA會被相應(yīng)的熒光探針所標記，從而準確的檢測細胞的增殖能力。本試劑盒采用流式細胞儀488nm激發(fā)光的熒光信號，可以檢測貼壁細胞、懸浮細胞的細胞增殖。 與CCK8/MTT檢測細胞增殖相比，EdU增殖檢測可以精確檢測單一細胞的增殖情況。
使用方法	一、自備試劑及儀器 1.試劑類： 細胞重懸液：含3%BSA的PBS緩沖液（pH 7.2-7.6）； 細胞通透液：含0.3%Triton X-100的PBS緩沖液（pH 7.2-7.6）； 細胞固定液：含4%多聚甲醛的PBS緩沖液（pH 7.2-7.6）； 其他：去離子水等。 2.儀器類： 熒光顯微鏡、離心機、離心管、移液器及Tip頭等。 二、試劑配制 Click Additive溶液配制:取1.1 mL去離子水加入到一管Click Additive(220mg)中，混勻至全部溶解。配制后可以適當分裝，并于-20℃保存。 注意：建議使用完一管Click Additive后再融化下一管。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后方可使用。如該溶液顏色變成棕色，說明組分的有效成分已失效，請棄用。 三、實驗步驟 1.細胞培養(yǎng) （以6孔板為參考，其他培養(yǎng)孔可根據(jù)實驗需要進行適當調(diào)整。）每孔1x10^5-3x10^6細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。 注：細胞接種量，可根據(jù)細胞大小、生長速度、以及實驗處理周期等調(diào)整。 2.細胞干預(yù)或者處理 （選做）可以根據(jù)實驗需要對細胞進行藥物或者其他刺激干預(yù)處理。 3.EdU和細胞共孵育培養(yǎng) 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，用細胞培養(yǎng)基按比例稀釋EdU溶液，或者按比例在孔板培養(yǎng)液中加入適量的EdU溶液與細胞共同孵育，同時設(shè)置不添加EdU組作為陰性對照組。每孔加入配制的稀釋后的EdU培養(yǎng)液共同孵育2h，去除舊培養(yǎng)液。 注意：a.EdU的標記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦以10μM的EdU初始濃度進行摸索，請?zhí)崆白鲱A(yù)實驗確認EdU的最佳使用濃度。b.EdU的濃度與孵育時間有關(guān)，短時間孵育宜采用高濃度（10-50μM），長時間孵育宜采用低濃度（1-10μM）。c.孵育時間與細胞生長速度有關(guān)，大多數(shù)腫瘤細胞系均可以采用2h孵育時間。常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25h，參考孵育時間宜在2h左右。人胚胎細胞的細胞周期約30min，參考推薦的孵育時間為5min；酵母細胞的細胞周期約3h，參考推薦的孵育時間為20min，增殖的神經(jīng)細胞周期約5天，參考推薦的孵育時間為1天。對于孵育時間小于45min時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20h時，建議適當降低EdU的濃度。d.EdU稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用。 4.細胞處理 1)孵育完成后，棄去培養(yǎng)基。 2)每孔加入1 mL含4%多聚甲醛固定，室溫孵育15 min后棄去4%多聚甲醛固定液。 3)每孔加入1 mL含3%BSA溶液，充分洗滌3次，每次5 min。 4)吸棄上清，每孔加入1 mL 0.3%Triton X-100溶液進行通透，室溫孵育20 min。 5)吸棄通透液，每孔加入1 mL 3%BSA溶液，充分清洗3次，每次5 min。 注意：第二次清洗完成，加清洗液后，加3%BSA溶液浸潤孔板，準備進行配置下面的Click反應(yīng)液體系。 5.熒光標記 1)按照說明書順序及實驗樣本數(shù)或者孔板數(shù)量配制標記工作液，按以下樣本數(shù)下的各組分比例配置Click反應(yīng)液體系。 注意：本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。如果是12孔板、24孔板、48孔板、96孔板，每孔的反應(yīng)的體系則分別為400μL、250μL、150μL、100μL的反應(yīng)混合物總體積。配置時，請按照順序配制，以免漏加或者多加。以上配置的Click反應(yīng)液在配置后15min內(nèi)使用，不宜長時間存放。如下以六孔板中的細胞樣品為例說明具體的操作方法。 2)吸棄清洗液，每孔加入上述表格配制的500μL的Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保Click反應(yīng)液均勻覆蓋細胞，室溫避光孵育30 min。 3)吸棄反應(yīng)液，每孔加入1 mL的3%BSA洗滌3次，每次5 min。 4)DNA染色：吸棄清洗液，每孔加入500μL DAPI工作液，室溫避光孵育5~10min。吸棄DAPI工作液，每孔加入1 mL含3%BSA洗滌3次，每次5 min。 注：DAPI溶液的用量需要根據(jù)孔板大小適量調(diào)整，以完全覆蓋每孔整個底面積為準則。 6.上機檢測 選擇488nm激發(fā)光下的綠色熒光信號，SUNNCELL488 Azide II的最大激發(fā)波長是488 nm，最大發(fā)射波長是519 nm。選擇358nm激發(fā)波長，461nm發(fā)射波長檢測DAPI熒光。為避免熒光淬滅，請盡快檢測。
產(chǎn)品組分
存儲條件	-20℃（SNK-013c SNK-013f需避光保存）
保質(zhì)期	一年

注意事項：
1.規(guī)格50 T指是用6孔板進行實驗可以檢測50個樣本。EdU(10 mM)首次使用時需要分裝（推薦50μL/小瓶或根據(jù)實驗需要分裝成更少量）。
2.實驗結(jié)果需用熒光顯微鏡儀進行檢測。
3.熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅,在進行熒光觀察時,盡量縮短觀察時間,同時在操作和存放過程中也盡量注意避光。
4.銅離子會影響GFP、RFP、mCherry等熒光蛋白的熒光，因此本試劑盒不適用于帶GFP、RFP、mCherry等熒光的細胞檢測。
5.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用。
6.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。