近期CDE發(fā)布了《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則 (試行)》，原文中對(duì)產(chǎn)品雜質(zhì)做了闡述。在病毒生產(chǎn)過(guò)程中，由于病毒包裝不完整或錯(cuò)誤包裝從而產(chǎn)生產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，產(chǎn)品雜質(zhì)一般包括分子變體、非完整包裝病毒（如非包 膜病毒顆粒、空殼病毒顆粒等）、錯(cuò)誤包裝病毒顆粒、無(wú)活性 病毒顆粒、病毒顆粒聚集體等。原則中建議采用適宜的方法進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行安全性評(píng)估。對(duì)產(chǎn)品安全性和/或有效性無(wú)影響的物質(zhì)歸類(lèi)為工藝相關(guān)物質(zhì)，需要在合適的階段進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確保批間的一致性。此外，國(guó)際上ICH制定的《基因治 療產(chǎn)品非臨床生物分布考慮》指導(dǎo)原則，將溶瘤病毒歸到基因治 療大類(lèi)，也對(duì)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)做出了類(lèi)似的規(guī)范。

對(duì)于溶瘤產(chǎn)品的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢測(cè)并非易事，主要原因在于產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和目標(biāo)產(chǎn)品的粒徑大小、分子量、電荷等差異較小，常規(guī)手段難以達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)及定量的目的?；诿芏群统两迪禂?shù)對(duì)顆粒進(jìn)行區(qū)分是經(jīng)典的分離/分析方法。CDE近日發(fā)布的《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則 (試行)》也將分析型超速離心技術(shù)列為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)推薦方法。

溶瘤病毒指導(dǎo)原則通告及局部?jī)?nèi)容一覽

溶瘤病毒是一類(lèi)可選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制進(jìn)而裂解腫瘤細(xì)胞、激活腫瘤免疫，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響的一類(lèi)病毒，包括RNA和DNA病毒等，可以治 療多種類(lèi)型的腫瘤。常見(jiàn)的溶瘤病毒包括：腺病毒、皰疹病毒、?？刹《尽⒑裟c孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、水皰性口炎病毒、新城疫病毒及痘病毒等。

針對(duì)于溶瘤病毒產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)品雜質(zhì)可通過(guò)分析型超速離心法（AUC）進(jìn)行檢測(cè)。AUC是一項(xiàng)曾榮獲諾獎(jiǎng)的經(jīng)典技術(shù)，其發(fā)明人為瑞典著名物理化學(xué)家Svedberg。

瑞典著名物理化學(xué)家Svedberg

沉降系數(shù)是生物大分子的特征常數(shù)，分子變異體、非完整包裝病毒(非包膜病毒、空殼病毒)及病毒聚體等，雖然它們粒徑差異很?。ň奂w除外），但沉降系數(shù)存在較大差異，故可以通過(guò)AUC技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，在體內(nèi)基因治 療領(lǐng)域，AUC-SV法是檢測(cè)AAV產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

            分析型超速離心機(jī) (AUC) 

硬件構(gòu)成                                                                              可視化離心過(guò)程

目前上市的四款溶瘤產(chǎn)品，兩款產(chǎn)品基于皰疹病毒，一款基于腺病毒，另一款基于?？刹《尽０捳畈《境是蛐?，二十面體對(duì)稱(chēng)，雙鏈DNA，皰疹病毒較大，直徑為150-200nm，具有包膜，“naked”病毒顆粒直徑100nm。AUC檢測(cè)皰疹病毒的結(jié)果如下圖所示：A表示的是由于DNA包裝失敗病毒顆粒(empty)；B表示的是含有支架蛋白核心，但不含DNA的病毒顆粒 (empty)；C為成熟病毒顆粒，包裹著DNA  (full) [1]。

皰疹病毒AUC檢測(cè)結(jié)果

皰疹病毒電鏡檢測(cè)結(jié)果

腺病毒呈球形，二十面體對(duì)稱(chēng)，雙鏈DNA，DNA在兩端具有約100bp的倒置末端重復(fù)。腺病毒直徑70-90nm，無(wú)包膜，沉降系數(shù)645S，AUC檢測(cè)結(jié)果如下，從結(jié)果中可以得到其空殼、單體及聚集體含量的百分比[2]。

腺病毒AUC檢測(cè)結(jié)果

?？刹《?Echovirus)屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，無(wú)包膜、單鏈RNA(+)家族，直徑24-30nm，蛋白衣殼占病毒顆粒的75%。埃可病毒成熟顆粒沉降系數(shù)143S。80S處的顆粒為Empty(含量~50%)，143S處的顆粒為成熟full病毒顆粒(~43%)，80S和143S之間的為partial，為Expanded intermediate病毒顆粒 (含量~7%)[3]。

埃可病毒AUC檢測(cè)結(jié)果                                  ?？刹《倦婄R檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于腸道病毒屬柯薩奇病毒（Coxsackievirus）[4]和脊髓灰質(zhì)炎病毒[5]，二者皆為無(wú)包膜、單鏈RNA(+)病毒，二十面體結(jié)構(gòu)，其空殼及聚集體等皆可用AUC進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下：

柯薩奇病毒AUC檢測(cè)結(jié)果                    脊髓灰質(zhì)炎病毒AUC檢測(cè)結(jié)果

溶瘤病毒沉降系數(shù)一覽

上述介紹了根據(jù)沉降系數(shù)的差異，對(duì)相關(guān)溶瘤病毒進(jìn)行檢測(cè)。另外，根據(jù)密度差異，對(duì)病毒產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢測(cè)也是可行的。如下圖，基于密度差異，可對(duì)腺病純度進(jìn)行分析[6]。

腺病毒AUC檢測(cè)結(jié)果(基于密度差異)

對(duì)于另一些溶瘤病毒，可參考上述病毒或腺相關(guān)病毒空殼率的檢測(cè)思路。溶瘤病毒作為未來(lái)Z 具潛力和應(yīng)用前景的腫瘤治 療手段之一，相信在未來(lái)幾年將會(huì)有更多產(chǎn)品進(jìn)入臨床并步入收獲期！