將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，通過不斷累積熒光信號(hào)從而使對(duì)PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，實(shí)時(shí)檢測(cè)全程PCR擴(kuò)增過程，按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。

兩個(gè)概念

1.Ct值

t代表threshold，C代表Cycle，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即為Ct值的含義。

2.熒光域值(threshold)的設(shè)定

熒光本底信號(hào)為PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍為熒光域值的缺省設(shè)置。

傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的不足之處，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以將其有效的解決，使得熒光信號(hào)的強(qiáng)度每一輪循環(huán)就能夠檢測(cè)一次并且在電腦上記錄下來得以實(shí)現(xiàn)。在電腦軟件之中，通過計(jì)算每個(gè)樣品Ct值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線就能將定量結(jié)果得到。所以基于如下兩點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以不需要內(nèi)標(biāo)。

a.Ct值與起始模板的線性關(guān)系

因?yàn)镃t值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，未知樣品的定量測(cè)定能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

b.Ct值的重現(xiàn)性

PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期）剛剛進(jìn)入，這個(gè)時(shí)間誤差很小，還沒有被放大，所以Ct值有極好的重現(xiàn)性，也就是時(shí)間相同不同管內(nèi)擴(kuò)增或者不同時(shí)間相同模板擴(kuò)增，會(huì)得到相同的Ct值。

特點(diǎn)

1.重復(fù)性好

2.檢測(cè)速度快

3.自動(dòng)化程度高

4.特異性強(qiáng)

5.靈敏度高