將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)不斷累積熒光信號(hào)從而使對(duì)PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，實(shí)時(shí)檢測(cè)全程PCR擴(kuò)增過(guò)程，按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。

技術(shù)原理

混合模板DNA和有熒光素的Taqman探針，遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律使高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)完成，切斷和模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針，熒光素在反應(yīng)體系中游離。熒光在特定光激發(fā)下發(fā)出，被擴(kuò)增的目的基因片段隨著循環(huán)次數(shù)的增加呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，Ct值根據(jù)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度求取出來(lái)，同時(shí)對(duì)照多個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，就能夠使待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)得出。

熒光化學(xué)分方法

實(shí)時(shí)熒光定量常用的熒光化學(xué)分為有Tag Man探針?lè)ê蚐YBR Green I法兩類。

1.TaqMan探針?lè)?/span>

TaqMan 探針?lè)ㄊ蔷哂懈叨忍禺愋缘亩縋CR技術(shù)。它的工作原理為有一對(duì) PCR 引物和一條探針存在于PCR 反應(yīng)體系中，有熒光淬滅基團(tuán)存在于3′ 端標(biāo)記，有報(bào)告基團(tuán)存在于探針的5′ 端標(biāo)記，探針僅和模板特異結(jié)合，兩條引物之間是其結(jié)合點(diǎn)。因此信號(hào)儀器搜集不到，伴隨反應(yīng)的進(jìn)展，Taq酶遇到探針，探針在外切核酸酶的活性的作用下被切斷，從而造成淬滅基團(tuán)不能吸收基團(tuán)的熒光能量，從而使熒光信號(hào)產(chǎn)生，所以模板 DNA 的拷貝數(shù)取決于信號(hào)的強(qiáng)度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I為一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，其發(fā)射波長(zhǎng)Zda約為 520 nm，Zda吸收波長(zhǎng)約為 497 nm，能夠結(jié)合所有的雙螺旋小溝區(qū)域。由于處于游離狀態(tài)，SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，然而其結(jié)合雙鏈 DNA之后，就會(huì)使得熒光大大增強(qiáng)，

熒光信號(hào)的增加完全同步PCR 產(chǎn)物的增加。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是其能夠?qū)λ衐sDNA 序列的擴(kuò)增進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有著比較簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法和比較低廉的成本，但是也正是因?yàn)闊晒馊玖夏軌蚪Y(jié)合所有的dsDNA 。那么非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體也能與染料結(jié)合，使熒光信號(hào)產(chǎn)生，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性，所以探針?lè)ǖ奶禺愋砸仍摲椒ǖ奶禺愋砸?。由于和目?biāo)產(chǎn)物相比較，非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的變性溫度要更加的低，因此，能夠在可以在熔解曲線反應(yīng)過(guò)程中，信號(hào)可以通過(guò)軟件分析儀器來(lái)收集從而鑒別。