Real-Time PCR 技術(shù)，又叫做實(shí)時定量熒光PCR，指的是將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，通過熒光信號累積對整個PCR進(jìn)程實(shí)時監(jiān)測，Z后通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析。

技術(shù)原理

定量PCR已經(jīng)從以凝膠為基礎(chǔ)的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)不但使PCR從定性到定量的飛躍得以實(shí)現(xiàn)，而且其比常規(guī)PCR有更強(qiáng)的特異性，對污染問題可以更加有效的解決和有更高的自動化程度。在PCR指數(shù)擴(kuò)增時，

特異性產(chǎn)物的量利用連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時測定，并且以此對目的基因的初始量進(jìn)行推斷，沒有必要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。作為一個非常有效的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)時定量PCR已經(jīng)在分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用。

常用方法

常用的方法有SYBR green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）兩種。

熒光染料摻入法

介紹：

將過量SYBR熒光染料加進(jìn)PCR反應(yīng)體系中，SYBR熒光染料特異性滲入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不滲入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而使熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步得到保證。

特點(diǎn)與適用性：

1.高通量大規(guī)模的定量PCR檢測。

2.沒有很高專一性要求的CR檢測。

3.具有很高的靈敏度，若使用SYBR，則會使得熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上。

4.具有良好的通性，不需要設(shè)計(jì)探針，方法簡單，節(jié)約時間，成本低。

5.方法通用性好，普遍應(yīng)用于國內(nèi)外科研領(lǐng)域。

探針法

介紹：

在PCR擴(kuò)增時，在將一對引物加入的同時再將一個特異性的熒光探針加入，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，淬滅基團(tuán)吸收報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號。PCR擴(kuò)增時，aq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，分離了報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)，所以，熒光信號可以被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到，就是每有一條DNA鏈擴(kuò)增，就會形成一個熒光分子，從而使得熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步實(shí)現(xiàn)。

特點(diǎn)與適用性：

1.存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對特異性要求較高的定量。

2.在人類傳染病的診斷和病原定量、生物制品的鑒定、畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫以及動物病原體基因的檢測方面得到廣泛地應(yīng)用。

3.適應(yīng)性高，可靠性強(qiáng)，穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有較好的重復(fù)性和更高的特異性。

4.對于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測很適用。

5.對于樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測很適用。

6.如果靶基因特異序列較短的話，那么不管對引物設(shè)計(jì)條件怎么優(yōu)化都不能解決。